養(yǎng)殖牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病的調(diào)查及診斷技術(shù)研究.pdf

1、魚類病毒性神經(jīng)壞死病是近年來嚴(yán)重危害海淡水魚類，引起世界范圍內(nèi)暴發(fā)性流行的重大傳染病之一。目前，已知包括鰻鱺目、鱈形目、鱸形目、鰈形目和鲀形目在內(nèi)的40多種魚類受神經(jīng)壞死病毒感染，病毒可通過垂直和水平兩種途徑傳播。仔魚和稚魚易受感染，病死率達(dá)90％以上，甚至100％。因此，該傳染病被國際獸疫局(OIE)列為重要的魚類病害(OIE,2000)。感染養(yǎng)殖牙鲆在我國屬首次報(bào)道。抗生素及化學(xué)藥物等均對該病作用很小，目前尚無有效的治療方法。因此，

2、建立快速靈敏的神經(jīng)壞死病毒檢測方法，及時(shí)預(yù)測預(yù)報(bào)病毒性神經(jīng)壞死病的發(fā)生成為當(dāng)務(wù)之急。為了盡快建立起行之有效的針對養(yǎng)殖牙鲆神經(jīng)壞死病毒的預(yù)警機(jī)制，作者經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查，通過篩選引物建立了適合于牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病的巢式RT-PCR檢測方法。主要的結(jié)果和結(jié)論如下： 1、作者對天津地區(qū)養(yǎng)殖牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病的流行及危害情況進(jìn)行了調(diào)查。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病主要危害牙鲆幼魚，患病魚體平均長度為3.50±0.48cm，平均重量為1.2±0.43g

3、。臨床癥狀主要表現(xiàn)為厭食，體色變黑，螺旋狀或旋轉(zhuǎn)游動，反應(yīng)遲鈍等。魚體發(fā)病后數(shù)天內(nèi)出現(xiàn)死亡，累計(jì)死亡率超過70％。腦組織超薄切片觀察發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞胞質(zhì)中存在大量病毒粒子，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的空包化病變，病毒粒子呈晶格狀排列， 30～35 nm，二十面體，無囊膜。 2、病原學(xué)調(diào)查結(jié)果表明：使用國際獸疫局(OIE)推薦的引物擴(kuò)增NNV基因RNA2的靶序列(421bp)片段，測序后進(jìn)行同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，該病毒PONNV與中國大陸報(bào)告

4、的ECNNv和中國臺灣報(bào)告的MNNV核酸同源性最高，分別達(dá)到98％和97％，與RGNNV、DLEV和DNNV的同源性也超過90％，與其他基因型的NNV同源性均低于80％，與BBV、BOV和FHV等3種α諾達(dá)病毒的核酸同源性小于10％。因此確定該病毒屬于RGNNV基因型。 3、根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫GeneBank中公布的DNNV(dragon nervous necrosis virus)、JFNNV(Japanese flounder

5、 nervous necrosis virus)和DLEV(Dicentrarchus labrax encephalitis virus)3種海水魚類神經(jīng)壞死病毒的基因組序列，采用Primer Premier5.0軟件在衣殼蛋白高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了3套nested-PCR引物，經(jīng)過反應(yīng)體系優(yōu)化，建立了針對牙鲆神經(jīng)壞死病毒的檢測方法。3套引物(M2,L2,M5,L5； M2，L4，M5，L5；M3，L3，M3，L5)分別擴(kuò)增片斷長度