胃寧顆粒對(duì)胃癌前病變E-cadherin、P16、c-myc基因甲基化的相關(guān)調(diào)控.pdf

1、目的:通過(guò)對(duì)大鼠胃癌前病變組織中E-cadherin、P16、c-myc基因甲基化的檢測(cè)，研究胃寧顆粒對(duì)胃癌前病變表觀遺傳修飾作用。
　　 方法:健康Wister大鼠60只，雄性，體重(280±20)g，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組、胃寧顆粒治療組高劑量組、中劑量組、低劑量組。除正常組正常飼養(yǎng)外，其余各組大鼠每日自由飲用180μg/mlN-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)液;每周給予每只大鼠56℃10％鹽水1ml灌胃1次;

2、每進(jìn)食2天禁食1天，進(jìn)食當(dāng)天下午每只大鼠用20mmol(0.85％)脫氧膽酸鈉溶液灌胃;禁食當(dāng)天下午每只大鼠用1ml乙醇灌胃;每周用鉗子夾住大鼠尾部一次，使之保持激怒、爭(zhēng)奪狀態(tài)，持續(xù)10分鐘。造模同時(shí)治療組按高、中、低不同劑量給藥。連續(xù)24周后，經(jīng)隨機(jī)病理檢測(cè)，提示胃癌前病變動(dòng)物模型復(fù)制成功，全部處死。采用甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR，MSP)方法檢測(cè)正常組、模型組、治療組（高、中、低）中E-cad

3、herin、P16、c-myc基因甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果:(1)一般情況:在正常組大鼠中，大鼠表現(xiàn)出神態(tài)安逸，形體肥胖，被毛光澤且貼身，食量大而穩(wěn)定，大便顆粒狀，尾部色淡紅，活動(dòng)靈敏;在模型組大鼠中，大鼠表現(xiàn)出精神萎靡不振，形體消瘦，被毛蓬松且無(wú)光澤，食量少而不定，大便塘爛，尾部色淡白或蒼白，懶于活動(dòng)且反應(yīng)遲鈍;高、中、低劑量組食量和體重均上升，大便成形，活動(dòng)增加等上述表現(xiàn)均不同程度好轉(zhuǎn)。
　　 (2)病理學(xué)變化①肉眼

4、觀察:大鼠造模至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組大鼠胃腔完整，未出現(xiàn)變形，胃壁厚薄適中未見異常，胃粘膜光滑平整;模型組大鼠胃腔已變形，胃壁增厚且伸展性差皺壁平坦，部分大鼠胃粘膜充血，偶有少量的點(diǎn)狀出血，部分大鼠胃粘膜粗糙呈灰白色或粘膜黃染;病檢的2只模型大鼠，其中1例于十二指腸處出現(xiàn)增生性結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)黃豆大小，菜花狀，性質(zhì)硬（組織學(xué)檢查確診為早期腺癌），另一例于胃竇部出現(xiàn)潰瘍樣缺損，綠豆大小，缺損粘膜粗糙潮紅伴糜爛（組織學(xué)檢查確診為消化性潰瘍）;胃寧顆

5、粒高、中、低劑量組大鼠粘膜較光滑呈粉紅色，皺壁排列較規(guī)則，未見增生性結(jié)節(jié)及潰瘍。②HE(HaematoxylinEosin)染色光學(xué)顯微鏡下觀察:胃寧顆粒正常組大鼠胃黏膜見上皮完整，上皮細(xì)胞的排列整齊且未見脫落或缺損，固有膜腺體形狀規(guī)則，以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主;模型組大鼠胃黏膜粗糙、糜爛、不完整，鏡下可見不同程度的變性或壞死的脫落細(xì)胞，主要為淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和少量單核細(xì)胞浸潤(rùn)的炎細(xì)胞，腺體不同程度的減少和出現(xiàn)腸上皮化生

6、;高、中、低治療組大鼠胃黏膜完整，以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，受浸潤(rùn)的炎細(xì)胞數(shù)量低于其它各組。
　　 (3)透射電鏡觀察結(jié)果:在正常組中大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞的排列較為規(guī)則且緊密，腺腔排列規(guī)則整齊，腺體豐富，各類細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器較豐富;模型組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞的間隙出現(xiàn)增大，粘液細(xì)胞核可見畸形、固縮，各類細(xì)胞器均減少、變形，腺腔內(nèi)微絨毛消失可見腸型微絨毛;經(jīng)胃寧顆粒干預(yù)治療后，高、中、低組大鼠胃粘膜中各類細(xì)胞器數(shù)量較模型組增多，腺腔內(nèi)短微

7、絨毛增多，而腸型微絨毛則減少或消失。(4)造模24周后，模型組大鼠病理診斷出現(xiàn)腸化生、不典型增生等病理改變。E-cadherin基因x2值18.720，P=0.001＜0.01;P16基因x2值23.180，P=0.000＜0.01;c-myc基因x2值13.486，P=0.009＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用bonferroni法調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)做高中低各組兩兩比較，α=0.0125。模型組與正常組比較，E-cadherin基因x2值18.2

8、37，P=0.000＜0.0125;P16基因x2值18.237，P=0.000＜0.0125;c-myc基因x2值13.486，P=0.009＜0.01證明造模成功。(5)高、中、低治療組大鼠病理診斷呈不同程度糜爛但較模型組輕。用bonferroni法調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)做高中低各組兩兩比較，α=0.0125。E-cadherin基因各治療組與模型組比較P＞0.0125無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;各治療組之間P＞0.0125無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P16基因高劑量組

9、與模型組比較P＞0.0125無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中、低治療組與模型組比較P＜0.0125有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。c-myc基因高、低劑量組與模型組比較P＞0.0125無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中劑量組與模型組比較，x2值9.036P=0.005＜0.0125有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:(1)模型的制作成功并且較為理想:本實(shí)驗(yàn)選用雄性大鼠，采用以MNNG液為主誘導(dǎo)癌變，通過(guò)模擬成食、燙熱（15％熱鹽水）、模擬膽汁返流（0.85％脫氧膽酸鈉）、模擬酒精等刺激（

10、40％酒精）等因素的加以運(yùn)用，并結(jié)合一些中醫(yī)病因中諸如饑飽失常、夾尾等導(dǎo)致精神情志失調(diào)的多因素聯(lián)合攻擊的方法，成功將胃癌前病變的大鼠模型復(fù)制成功，使人類胃癌前病變的病理改變特征得以呈現(xiàn)。最后，模型組大鼠沒有一例恢復(fù)正常，因此本實(shí)驗(yàn)制造的大鼠模型具有穩(wěn)定性強(qiáng)重復(fù)性好成功率高，不僅能夠模擬可能引起人的致病因素，又結(jié)合了中醫(yī)病因，而且有效的縮短了造模的時(shí)間，是一種較為理想的胃癌前病變模型的制造方法。
　　 (2)胃寧顆粒對(duì)胃癌前病變表

11、觀遺傳修飾作用:胃寧顆粒對(duì)E-cadherin基因甲基化無(wú)相關(guān)作用;對(duì)p16、c-myc基因甲基化發(fā)生相關(guān)調(diào)控作用。
　　 (3)體現(xiàn)了中醫(yī)藥優(yōu)越性:胃癌前病變屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“痞癥”范疇，病因病機(jī)較復(fù)雜，但其基本病理病機(jī)的改變即肝脾（胃）不調(diào)，從而變生為氣機(jī)升降出入失調(diào)、氣滯血瘀、寒熱虛實(shí)錯(cuò)雜等病理情況。治療上宜調(diào)和肝脾（胃）、行氣活血、兼調(diào)寒熱。胃寧顆粒以益氣健脾，活血化瘀抗癌，既能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，又可扶正去邪去除病因，在改善胃