“他莫昔芬-let-7g-靶蛋白”通路調(diào)控子宮內(nèi)膜癌RL-95-2細胞增殖的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　TAM(Tamoxifen，他莫昔芬)是雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)的選擇性調(diào)節(jié)劑，在用于治療ER陽性乳腺癌患者過程中發(fā)現(xiàn)可增加子宮內(nèi)膜增生和惡性腫瘤的風(fēng)險，認(rèn)為這與TAM在子宮膜組織中有弱雌激素樣作用相關(guān)[1]。let-7g是內(nèi)源性非編碼RNA(MicroRNA，miRNA)，近年來有研究證實其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重大作用。本研究以子宮內(nèi)膜癌RL-95-2細胞為實驗對象，擬觀察不同濃度

2、TAM作用下，細胞生長及l(fā)et-7g的表達水平的變化，以探明TAM與let-7g之間的調(diào)控關(guān)系，并運用生物信息學(xué)方法和實驗室手段，預(yù)測let-7g可能的靶基因，初步探討TAM、let-7g在子宮內(nèi)膜癌中的作用及可能的分子機制。為進一步認(rèn)識子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機理提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用免疫熒光技術(shù)檢測細胞中ER表達。
　　2.不同濃度TAM處理RL-95-2細胞后，采用CCK-8法檢測吸光度值（OD值變

3、化），觀察TAM對細胞增殖的影響;流式細胞術(shù)分析細胞周期的變化，實時熒光定量PCR(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)法檢測let-7g的表達變化。
　　3.借助生物信息學(xué)軟件預(yù)測let-7g的靶標(biāo)基因并對其進行生物學(xué)功能分析。
　　4.上調(diào)或下調(diào)let-7g表達:CCK-8法測定對細胞增殖的影響，RT-qPCR檢測let-7g的表達及靶基因RB

4、1 mRNA表達，Western Blot檢測RB1蛋白的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.子宮內(nèi)膜癌RL-95-2細胞中ER表達陽性。
　　2.(1)與對照組相比，處理48h后濃度為1×10-7 mol/L的TAM使細胞OD值增加(P＜0.05)，濃度為1×10-4mol/L的TAM使細胞OD值降低(P＜0.05);處理72 h后濃度為1×10-9～1×10-5 mol/L的TAM使細胞OD值明顯增高(P＜0.05)，

5、在濃度為1×10-7mol/L時OD值最高(P＜0.01)，而當(dāng)TAM濃度為1×10-4 mol/L時細胞OD值降低(P＜0.05)。(2)與對照組相比，1×10-7 mol/L的TAM作用于RL-95-2細胞72 h后，G0/G1期細胞明顯減少，而S期細胞增多(P＜0.05)。(3)與對照組相比，TAM濃度為1×10-9～1×10-5 mol/L時，let-7g表達量較高(P＜0.05)，當(dāng)TAM濃度為1×10-7 mol/L時let

6、-7g的表達量最高(P＜0.01)，1×10-4mol/L的TAM則使let-7g的表達下降(P＜0.01)。
　　3.經(jīng)生物信息學(xué)的方法預(yù)測和分析，篩選出了6個與細胞生長密切相關(guān)的let-7g靶基因:UHRF2、RB1、GAS7、PLAGL2、NAB1和ZNF282，并著重對RB1進行了分析。
　　4.上調(diào)細胞中l(wèi)et-7g表達，使OD值增加(P＜0.05)、RB1蛋白的表達顯著增高(P＜0.01)，下調(diào)細胞中l(wèi)et-7g