卵巢儲(chǔ)備功能不良女性GDF-9表達(dá)、基因變異和功能研究.pdf

1、卵巢儲(chǔ)備功能是指卵巢內(nèi)存留的卵泡數(shù)量和質(zhì)量,反映女性的生育潛能。卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱,卵母細(xì)胞質(zhì)量下降,稱為卵巢儲(chǔ)備不良或卵巢儲(chǔ)備功能下降,進(jìn)一步可發(fā)展為卵巢早衰,極大威脅女性生殖健康。既往對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能的研究主要集中于尋找出可以預(yù)測(cè)、評(píng)判卵巢功能的指標(biāo),然而關(guān)于卵巢功能下降的確切機(jī)制研究甚少。
　　 普遍認(rèn)為年齡是影響卵巢功能的最重要因素。但是卵巢衰老發(fā)生存在極大的個(gè)體差異性,提示我們卵巢內(nèi)部因素比年齡更能決定生育儲(chǔ)備。卵泡

2、生長(zhǎng)發(fā)育異常、顆粒凋亡加速導(dǎo)致卵泡閉鎖是卵巢儲(chǔ)備功能下降的根本原因。研究參與調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)、閉鎖過(guò)程的基因?qū)τ诮沂韭殉矁?chǔ)備功能下降的機(jī)制有著重要意義。目前認(rèn)為卵母細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子對(duì)卵泡及周圍細(xì)胞發(fā)育發(fā)揮重要作用。
　　 生長(zhǎng)分化因子-9(Growth Differentiatoin Factor-9,GDF-9)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的卵母細(xì)胞分泌因子,屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF

3、-β)超家族成員。已經(jīng)證實(shí),GDF-9參與了卵泡生長(zhǎng)、閉鎖；顆粒細(xì)胞增殖,凋亡；排卵發(fā)生；卵母細(xì)胞成熟；卵巢內(nèi)激素及細(xì)胞因子的分泌?；谠诼雅莅l(fā)育成熟過(guò)程中的重要作用,GDF-9被認(rèn)為是卵泡發(fā)育異常相關(guān)疾病的重要候選基因,多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)表現(xiàn)出卵巢組織GDF-9蛋白表達(dá)顯著下降,卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)存在相關(guān)突變位點(diǎn)。而在異

4、卵雙胎母親也發(fā)現(xiàn)了GDF-9基因變異。提示GDF-+9在女性卵巢發(fā)育及排卵中具有重要作用。但是目前關(guān)于GDF-9基因與卵巢儲(chǔ)備功能方面的研究至今尚無(wú)報(bào)道。
　　 本研究擬從蛋白表達(dá)和基因水平著手,分析卵巢儲(chǔ)備功能不良女性GDF-9基因的表達(dá)、突變及其功能狀態(tài),以期揭示GDF-9蛋白分泌和基因異常介導(dǎo)卵巢儲(chǔ)備功能下降發(fā)生的可能分子機(jī)制,為拯救女性生育力提供理論基礎(chǔ)和新思路
　　 第一部分 GDF-9蛋白表達(dá)與卵巢儲(chǔ)備功能的

5、關(guān)系及其對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控
　　 目的:檢測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能不良女性卵泡液GDF*9蛋白及顆粒細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)水平,并進(jìn)一步研究GDF-9蛋白對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。
　　 方法:以68例卵巢低反應(yīng)患者為研究對(duì)象,同時(shí)以97例卵巢正常反應(yīng)者為對(duì)照組,Western Blot分析卵泡液中GDF-9表達(dá)與卵巢反應(yīng)性的關(guān)系,同時(shí)采用Real-time檢測(cè)卵巢低反應(yīng)患者顆粒細(xì)胞p35 mRNA表達(dá)。人黃素化顆進(jìn)行原代培養(yǎng)粒細(xì)

6、胞,并給予不同濃度重組GDF-9(0-300ng／mL)刺激,Real-time檢測(cè)p53mRNA表達(dá),Western Blot檢測(cè)p53蛋白水平表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.卵巢低反應(yīng)患者卵泡液GDF-9蛋白表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組,卵巢低反應(yīng)患者顆粒細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組；2.給予原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞不同濃度GDF-9作用24h,隨GDF-9濃度的增加(Ong／ml,30ng／ml,100ng／ml,300ng／

7、ml),顆粒細(xì)胞p53 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下降。
　　 結(jié)論:1.卵泡液GDF-9蛋白水平下降與卵巢儲(chǔ)備功能下降相關(guān)；2.誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)上調(diào),促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡,加速卵泡閉鎖,可能降低的GDF-9蛋白水平參與卵巢儲(chǔ)備功能不良發(fā)生的機(jī)制之一。
　　 第二部分卵巢儲(chǔ)備功能不良女性GDF-9基因變異研究。
　　 目的:對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能不良女性進(jìn)行GDF-9基因篩查,分析其SNPs與卵巢儲(chǔ)備功能下

8、降的關(guān)系,并試圖揭示卵巢儲(chǔ)備功能不良導(dǎo)致女性生殖潛能下降的機(jī)制。
　　 方法:以106例卵巢儲(chǔ)備功能下降女性為研究對(duì)象,同時(shí)采集123例健康、卵巢功能正常的生育期女性外周血作為正常對(duì)照。利用直接測(cè)序法篩查卵巢儲(chǔ)備功下降女性GDF-9基因變異情況,分析SNPs基因型與卵巢儲(chǔ)備功能、IVF結(jié)局的關(guān)系。
　　 結(jié)果:1.直接測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個(gè)已知的單核苷酸多態(tài):c.C447T,c.G546A；和2個(gè)新發(fā)突變:c.G169T(p

9、.D57Y),c.C436T(p.R164C)。2.對(duì)于GDF-9 G546A,GA／AA基因型頻率及A等位基因頻率在卵巢儲(chǔ)備下降女性中顯著高于正常對(duì)照組,而GDF-9 C447T基因型和等位基因頻率在兩組間沒(méi)有顯著性差異。3.卵巢儲(chǔ)備下降組中,與GG基因女性相比,攜帶GA／AA基因型女性其卵巢低反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)顯著贈(zèng)高,優(yōu)質(zhì)胚胎率和妊娠率顯著降低(p<0.01)。正常對(duì)照組中,GG和GA／AA基因型在這些指標(biāo)間沒(méi)有顯著差異(p>0.05

10、)。GDF-9 C447T三種基因型在兩組IVF結(jié)局中沒(méi)有明顯差異(p>0.05)。4.2個(gè)新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn),其中p.R164C僅發(fā)生于卵巢儲(chǔ)備功能下降女性,而p.D57Y在卵巢儲(chǔ)備下降組和正常對(duì)照組均有發(fā)生,且發(fā)生頻率無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:GDF-9 G546A與女性卵巢儲(chǔ)備功能不良密切相關(guān)。GA／AA基因型可能是導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能不良女性發(fā)生生殖潛能降低的機(jī)理之一。
　　 第三部分 GDF-9基因突變體的表達(dá)及功能研

11、究。
　　 目的:研究野生型和突變型GDF-9蛋白表達(dá)和生物學(xué)功能的差異,探討突變GDF-9基因引起卵巢儲(chǔ)備功能不良的發(fā)生機(jī)制。
　　 方法:利用分子克隆和定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建野生型真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4-Myc／His-GDF-9wt和突變型真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4-Myc／His—GDF-9D57Y,pcDNA4-Myc／His-GDF-9R164C,分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,經(jīng)Zecoin篩選建立GDF-9穩(wěn)定表達(dá)

12、HEK239T細(xì)胞系,Western Blot分析野生型和突變型蛋白分泌情況。用野生型和突變型重組蛋白刺激原代培養(yǎng)人黃素化顆粒細(xì)胞,Alarm Blue研究突變型蛋白對(duì)刺激顆粒增殖能力的影響,Western Blot分析其對(duì)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad-2磷酸化水平的作用。
　　 結(jié)果:1.p.R164C僅發(fā)生于2例卵巢儲(chǔ)備下降患者,該位點(diǎn)高度保守。p.D57Y發(fā)生6例卵巢儲(chǔ)備下降患者,同時(shí)見(jiàn)于2例正常對(duì)照女性(p>0.05)。2.

13、Western Blot分析證實(shí)p.R164C導(dǎo)致成熟蛋白分泌顯著減少,突變蛋白刺激顆粒增殖以及誘導(dǎo)Smad-2磷酸化的能力明顯降低。p.D57Y突變不影響蛋白的分泌,并且突變蛋白對(duì)顆粒細(xì)胞和Smad-2的作用與野生型蛋白無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:1.錯(cuò)義突變p.R164C影響成熟蛋白分泌,使GDF-9蛋白刺激顆粒細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)Smad-2磷酸化水平的能力下降。2.GDF-9基因突變導(dǎo)致的蛋白生物學(xué)活性下降可能是一部分卵巢儲(chǔ)備功