沙利度胺抑制兔實驗性腹主動脈瘤生長的研究.pdf

1、背景：
　　 腹主動脈瘤（abdominalaorticaneurysm，AAA）是腹主動脈的永久性、局限性擴張性疾病，多見于老年男性，男女發(fā)病率之比為3.5∶1，據(jù)統(tǒng)計，在65～80歲的男性人群中，AAA的患病率達4-8％。AAA年新發(fā)病率為0.4-0.67％。在美國，每年有約150，000名患者因AAA住院，超過30，000人行AAA開腹手術治療，有約15，000人最終死于AAA破裂。隨著年齡增長，AAA發(fā)病率呈逐漸增高趨勢

2、，瘤體年擴張率亦加快，一旦發(fā)生破裂，死亡率可達90％。AAA儼然已成為具有高致死率、嚴重威脅人類健康的主要疾病之一。
　　 AAA的高致死率主要緣于AAA的破裂。AAA直徑是預測其破裂風險和決定治療方式的主要指標。一般的，對于直徑≥5.5cm的AAA，其破裂的風險明顯增加，動脈瘤切除人工血管置換和腔內(nèi)支架隔絕術是防止AAA破裂的有效途徑。然而，對于直徑＜5.5cm、瘤體擴張緩慢、近期破裂的風險很低的無癥狀小AAA，建議定期隨訪觀

3、察。相關的臨床研究結果表明，對于小AAA，早期手術干預和定期隨訪觀察兩組患者的長期生存率并無明顯差異，即早期手術并不能明顯改善其長期生存率，這一結果也證實對于小AAA而言，定期隨訪觀察是相對安全的，建議可在瘤體直徑擴張率≥1cm/年或直徑達到5.5cm時再行常規(guī)開腹或腔內(nèi)修復術。但是，AAA的擴張是不可逆的，其一旦形成必然進行性增大，如果等到瘤體增大瀕臨破裂或出現(xiàn)癥狀再手術則隨著患者年齡增大、全身狀況進一步減退，手術治療風險將數(shù)倍于早期

4、治療。顯然，對于絕大多數(shù)小AAA患者，這種基于單純“觀察等待”基礎上的策略是不夠的，尋求一種更為積極的、無創(chuàng)的方法抑制甚或逆轉動脈瘤擴張、防止其破裂或降低破裂風險或許更有意義。
　　 AAA是遺傳、環(huán)境、生物化學等多因素共同作用的結果，動脈粥樣硬化、感染、炎癥性疾病、膠原及彈性蛋白遺傳缺陷、蛋白酶活性增強或抑制作用減弱以及機械性因素等，都有導致AAA的可能。各種因素導致血管壁受損，免疫反應被激活，引起局部炎癥細胞浸潤、炎癥遞質及

5、各種蛋白水解酶異常表達與活化，進而導致動脈中膜彈力蛋白降解、膠原纖維代謝失衡、血管平滑肌細胞凋亡，最終動脈壁失去彈性，不能耐受血流沖擊而進行性擴張形成動脈瘤。局部動脈瘤壁慢性炎癥、細胞外基質(ECM)降解和重構、血管平滑肌細胞凋亡以及新生血管生成是腹主動脈瘤的主要病理學特征，尤其是以巨噬細胞、淋巴細胞為主的透壁性炎癥細胞浸潤與腹主動脈瘤的擴張成正相關。其一，浸潤的炎性細胞可分泌大量的基質金屬蛋白酶(MMPs)和其他蛋白水解酶，引起主動脈

6、壁彈力蛋白和膠原纖維等結構性蛋白的降解，削弱動脈瘤壁、繼發(fā)附壁血栓形成進而導致動脈瘤進展;其二，炎性細胞在瘤壁中分泌如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、干擾素-γ（IFN-γ）等多種炎性細胞因子，進一步促進炎癥反應，加重動脈瘤的進展。動脈中層新生血管形成和血管平滑肌細胞減少也是腹主動脈瘤的重要特征。瘤腔內(nèi)的附壁血栓可引起內(nèi)膜組織細胞缺氧，進而誘發(fā)新生血管形成和炎癥。血栓內(nèi)的炎癥細

7、胞也可以釋放諸如MMP-9、尿激酶型纖溶酶原激活劑等活性蛋白水解酶。
　　 AAA形成及擴張機制的逐步闡明為應用藥物來延緩、阻止甚至逆轉動脈瘤的病理學進程提供了理論依據(jù)，即理論上通過藥物抑制動脈壁炎癥、新生血管生成以及調(diào)節(jié)免疫等方法可以抑制AAA的擴張。我們期待藥物干預能為小AAA的穩(wěn)定提供有效的治療。而相對于開發(fā)新藥，研究可能抑制AAA進程的現(xiàn)行一線臨床藥物的可行性可能更強。目前國外學者已經(jīng)開展并證實對AAA形成有抑制作用的藥

8、物包括他汀類藥物、四環(huán)素類、血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、免疫抑制劑、非甾體類抗炎藥、核因子κB(NF-κB)抑制劑及c-jun氨基末端激酶(JNK)抑制劑等。
　　 沙利度胺又名酞胺哌啶酮，最初作為鎮(zhèn)靜劑治療妊娠嘔吐，后因發(fā)現(xiàn)有明顯的致畸作用（嬰兒海豹肢）而被禁用。然而，各國學者對沙利度胺的研究從未因此停滯。近年來發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有顯著的抗炎、抗血管生成及免疫調(diào)節(jié)等作用而重新被應用于臨床，用于麻風結節(jié)性紅斑、系

9、統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤、類風濕性關節(jié)炎、白塞氏病等的治療并顯示出特有的療效。最近研究表明，沙利度胺對大鼠頸動脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的增生及兔動脈粥樣硬化形成有明顯抑制，其機制可能主要與其下調(diào)TNF-α的表達有關。
　　 基于炎癥、免疫機制在AAA形成、擴張過程中的重要作用及沙利度胺的抗炎、抗血管生成、免疫調(diào)節(jié)等藥理學作用，沙利度胺對AAA生長是否有抑制作用目前國內(nèi)外均未見有關研究。推測沙利度胺可能通過其抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗血管生

10、成作用在AAA的治療中亦起重要作用。
　　 目的：
　　 建立兔腎下AAA模型，就沙利度胺對AAA生長的影響從大體形態(tài)、影像學、組織病理學、分子生物學等方面進行全面、動態(tài)觀察，研究沙利度胺對AAA的擴張是否有抑制作用，在此基礎上進一步闡釋AAA的發(fā)病機制，為AAA的臨床藥物治療提供參考。
　　 方法：
　　 選取健康雄性新西蘭白兔（體重2.5-3.0kg），采用豬胰Ⅰ型彈力蛋白酶灌注腎下腹主動脈建立兔AA

11、A模型，術后1周對手術兔行腹主動脈超聲檢查，了解成瘤情況，測量灌注段最大內(nèi)徑，以灌注段腹主動脈擴張超過其近端正常腹主動脈直徑的50％作為造模成功標準，計算擴張率及造模成功率。為研究沙利度胺對腹主動脈瘤生長的影響，術后1周時超聲檢查確認造模成功的兔15只，單盲、隨機分為三組，即沙利度胺治療組(AAA/Thd，n=5)和模型對照組(AAA/Con，n=5)，于術后1周始，每天一次分別給予胃灌注沙利度胺生理鹽水懸液（100mg/kg/day與

12、5ml生理鹽水混勻）和生理鹽水（5ml/只/天），直至術后4周;其余5只術后1周時再次手術，以采集標本作為藥物干預前的基礎對照。另取未行手術造模的兔5只，于常規(guī)飼養(yǎng)1周后采集標本作為實驗正常對照。各組兔于術前及術后1周、2周、4周先后行多普勒超聲檢查，評價比較腹主動脈術后擴張情況，于術后1周、4周時同時行腹主動脈造影，進一步評價AAA擴張情況。標本采集前于生理壓力下測量、記錄腹主動脈最大外徑。采集的腹主動脈標本分成兩份，一份分割后立即置

13、于4％多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋用于組織病理學研究，另一份速凍于-80℃低溫冰箱備用于WesternBlot分析。術前及術后1周、4周時分組自兔耳緣靜脈采集靜脈血2ml，離心（3000轉/分鐘×5min，4℃）后取上清液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎锰K木素-伊紅(HE)染色和彈力纖維EVG染色分別評價沙利度胺治療前后動脈瘤壁炎性細胞浸潤、管腔化微血管密度變化及彈力纖維降解情況。采用免疫組化、Westernblot方法對組織標本中TNF

14、-α、MMP-9、VEGF等炎性細胞因子的表達進行定性和定量研究，分析比較沙利度胺對其表達的影響。采用ELISA法研究沙利度胺對循環(huán)促炎細胞因子TNF-α、IL-1β的影響。所有計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05判定差異的顯著性。
　　 結果：
　　 1.本課題應用腎下腹主動脈彈力蛋白酶加壓灌注法成功建立兔AAA實驗模型，18只兔分批建

15、模，術后1周內(nèi)死亡2只，1只截癱，術后1周超聲檢查確認共有15只造模成功，成瘤率85％。15只成模兔術前、術后1周超聲檢測其腹主動脈最大內(nèi)徑分別為2.9±0.3mm和5.0±0.7mm，平均擴張率為71％。其中5只成模兔在術后1周時處死采集標本，剖視動脈瘤見其內(nèi)膜失去正常光滑形態(tài)，壁增厚，有的腔內(nèi)有附壁血栓形成。
　　 2.為研究沙利度胺對AAA生長的影響，我們對兔AAA模型進行動態(tài)觀察和評價。彈力蛋白酶灌注前及灌注后1周，沙利

16、度胺治療組和模型對照組腹主動脈最大外徑、內(nèi)徑差異無統(tǒng)計學意義。彈力蛋白酶灌注后4周，模型對照組瘤體外徑較1周時明顯增大，而沙利度胺治療組動脈瘤的生長被顯著抑制，兩組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），治療組瘤體擴張率平均降低46％(AAA/Tha:5.2±0.4mmvs.AAA/Con:7.6±0.9mm,P＜0.001)。該結果進一步被超聲和血管造影檢查結果所證實。血管超聲檢測結果顯示，沙利度胺治療1周后，與模型對照組相比較，AAA擴

17、張明顯減緩，治療3周后動脈瘤最大內(nèi)徑明顯低于模型對照組，擴張率平均降低49％。血管造影結果顯示術后4周時沙利度胺治療組AAA擴張程度明顯低于模型對照組。
　　 3.為了觀察沙利度胺對兔AAA瘤壁炎癥反應及血管生成的影響，對各組組織樣本進行HE染色，顯微鏡下分別觀察炎癥細胞浸潤及管腔化微血管形成情況。結果顯示正常對照組腹主動脈壁無炎性細胞浸潤，彈力蛋白酶灌注后1周動脈瘤壁可見大量炎癥細胞浸潤，浸潤的炎癥細胞主要位于中膜及外膜，以淋

18、巴細胞和巨噬細胞為主;灌注后4周時模型對照組動脈瘤壁炎癥細胞浸潤進一步增多，與模型對照組相比，沙利度胺治療3周后，瘤壁炎癥顯著減輕，組間比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。彈力蛋白酶灌注后1周瘤壁管腔化微血管密度與正常腹主動脈相比未見明顯變化，彈力蛋白酶灌注后4周時模型對照組見動脈瘤壁外膜管腔化微血管明顯增加，沙利度胺治療組管腔化微血管則明顯低于模型對照組（P＜0.001）。
　　 4.免疫組化結果顯示，正常腹主動脈TNF-α、

19、MMP-9、VEGF均呈陰性表達，彈力蛋白酶灌注后1周表達均明顯增強，陽性表達部位多以中膜和外膜為主;術后4周時模型對照組陽性表達的區(qū)域及強度進一步增加，動脈壁全層均可見大量棕黃色顆粒，與模型對照組比較，沙利度胺治療組表達強度均明顯減弱。
　　 5.Westernblot分析進一步顯示，術后4周時沙利度胺治療組TNF-α、MMP-9、VEGF表達水平與模型對照組相比分別平均降低47％、48％、75％。
　　 6.ELIS

20、A法進一步檢測各組兔血清中TNF-α和IL-1β水平。結果顯示術后1周血清中TNF-α和IL-1β水平增高，術后4周時模型對照組TNF-α和IL-1β水平進一步明顯增高，而沙利度胺組呈現(xiàn)下降或僅輕度升高趨勢，與模型對照組相比有顯著性差異(P＜0.001)。
　　 結論：
　　 本課題采用彈力蛋白酶灌注法成功建立了穩(wěn)定的兔AAA實驗模型，首次證實沙利度胺可通過其抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗血管生成等藥理作用顯著抑制兔實驗性AAA的生