STAT3分子的磷酸化及其調(diào)控機(jī)制在電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)中的研究.pdf

1、腦血管病已經(jīng)成為我國人口的第一位致殘和致死性疾病,并且發(fā)病數(shù)量還有逐年增多的趨勢。過去幾年的流行病學(xué)研究結(jié)果表明,我國每年有160萬~200萬新發(fā)腦卒中的病例,現(xiàn)存的腦血管病患者700余萬人,其中約70％為缺血性腦卒中患者。缺血性腦卒中的損傷危害極大,能夠引起嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,降低中患者的生活質(zhì)量,病情嚴(yán)重的可危及生命。盡管已證實(shí)組織型纖維蛋白酶原激活劑(rtPA)能夠作為一種有效的藥物治療缺血性腦卒中疾病,但有效治療時(shí)間窗短(3.5

2、h以內(nèi)),對治療對象要求高的缺點(diǎn),使其在臨床治療工作中運(yùn)用受限(少于3%)。研究腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找有效的預(yù)防及治療手段一直是神經(jīng)科學(xué)研究的前沿性、熱點(diǎn)性課題。近年來已證實(shí)多種非缺血的預(yù)處理方法都能夠改善腦缺血再灌注損傷,我們科研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理能夠減輕腦缺血再灌注對神經(jīng)功能的損害,改善神經(jīng)功能,誘導(dǎo)腦缺血耐受。新近的研究結(jié)果證實(shí)電針預(yù)處理可能通過內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)及其相關(guān)信號蛋白發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,但其確切機(jī)制仍需進(jìn)一步闡

3、明。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在細(xì)胞生存和增殖調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮十分重要的作用,細(xì)胞的損傷能夠激活STAT3,使其發(fā)生磷酸化。實(shí)驗(yàn)中證實(shí)磷酸化的STAT3分子能夠有效發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,但該因子是否在電針誘導(dǎo)的腦缺血耐受保護(hù)效應(yīng)中發(fā)揮作用仍不清楚,本研究以大鼠腦中動脈阻閉(MiddleCerebralArteryOcclusion,MCAO)為腦缺血再灌注損傷模型,觀察電針預(yù)處理后大鼠腦缺血再灌注損傷過程中磷酸化STAT3分子的表

4、達(dá)及其神經(jīng)保護(hù)作用,并初步探討其在電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一
　　電針預(yù)處理腦保護(hù)作用及電針預(yù)處理對缺血后磷酸化STAT3分子表達(dá)的影響
　　方法
　　1.電針預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　清潔級雄性SD大鼠24只(280-320g),隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(Sham)、單純?nèi)毖俟嘧⒔M(MCAO)和電針預(yù)處理組(EA)。動物經(jīng)歷2h缺血后于再灌注72h處死,通過腦梗死容積和神

5、經(jīng)行為學(xué)評分的測定觀察電針預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　2.電針預(yù)處理腦缺血再灌注損傷后磷酸化STAT3分子的表達(dá)(pSTAT3)
　　雄性SD大鼠24只,分組同1。缺血2h后分別于再灌注6h和24h處死,進(jìn)行蛋白免疫印跡(Westernblotting),檢測再灌注損傷后pSTAT3表達(dá)情況。
　　3.電針預(yù)處理腦缺血再灌注損傷后活化STAT3表達(dá)的定位
　　雄性SD大鼠12只,分組同1。缺血2

6、h再灌注6h后將動物處死,制作冰凍切片,通過免疫熒光雙標(biāo)染色對目的蛋白進(jìn)行定位。
　　實(shí)驗(yàn)二
　　磷酸化STAT3分子參與電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受
　　方法
　　1.STAT3分子活化抑制劑PpYLKTK對pSTAT3表達(dá)的影響
　　雄性SD大鼠12只,隨機(jī)分為3組:Sham組、EA+PBS組和EA+Pp組。缺血2h再灌注6h處死進(jìn)行蛋白免疫印跡(Westernblotting),檢測再灌注損傷后pSTA

7、T3表達(dá)情況。
　　2.STAT3分子活化對電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)的影響
　　雄性SD大鼠32只,隨機(jī)分為4組:Sham組、MCAO組、EA+PBS組和EA+Pp組。動物經(jīng)歷2h缺血后于再灌注72h處死,通過腦梗死容積和神經(jīng)行為學(xué)評分的測定觀察STAT3分子活化同電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)之間的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)三
　　磷酸化STAT3分子對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
　　方法
　　1.STAT3分子活化對電針預(yù)處理保

8、護(hù)效應(yīng)中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
　　雄性SD大鼠16只,隨機(jī)分成4組:Sham組、MCAO組、EA+PBS組和EA+Pp組,缺血2h再灌注24h后將動物處死,進(jìn)行TUNEL和caspase3陽性細(xì)胞染色計(jì)數(shù),觀察STAT3分子活化對電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)中凋亡細(xì)胞數(shù)量的影響。
　　2.STAT3分子活化在電針預(yù)處理保護(hù)效應(yīng)中凋亡蛋白表達(dá)的影響
　　雄性SD大鼠16只,分組同1,缺血2h再灌注24h后將動物處死,進(jìn)行蛋白免疫印

9、跡(Westernblotting),檢測STAT3分子活化對電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)中凋亡蛋白表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)四
　　電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦保護(hù)效應(yīng)中STAT3分子磷酸化的調(diào)控機(jī)制
　　方法
　　1.CB1受體拮抗劑AM251及干涉RNA對電針預(yù)處理后活化STAT3分子表達(dá)的影響
　　雄性SD大鼠32只,隨機(jī)分為8組:其中MCAO組、EA組、EA+AM251組以及EA+vehicle組用于觀察AM251參與電

10、針預(yù)處理后對pSTAT3(Ser727)表達(dá)的影響,另外MCAO組、EA組、EA+CB1-siRNA組以及EA+control-siRNA組用于觀察干涉RNA參與電針預(yù)處理后對pSTAT3(Ser727)表達(dá)的影響。缺血2h再灌注6h處死進(jìn)行Westernblotting,檢測再灌注損傷后pSTAT3表達(dá)情況。
　　2.CB1受體激動劑WIN55,212-2和ACEA對電針與處理后活化STAT3分子表達(dá)的影響
　　雄性SD大

11、鼠24只,隨機(jī)分為6組:其中MCAO組、MCAO+WIN組、MCAO+vehicle組用于觀察WIN55,212-2對pSTAT3(Ser727)表達(dá)的影響,另外MCAO組、MCAO+ACEA組、MCAO+vehicle組用于觀察ACEA對pSTAT3(Ser727)表達(dá)的影響。缺血2h再灌注6h處死進(jìn)行Westernblotting,檢測再灌注損傷后pSTAT3表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1.電針預(yù)處理后腦缺血再灌注損傷的變

12、化及對STAT3分子磷酸化水平的影響
　　EA組大鼠的NDS評分明顯優(yōu)于MCAO組(P<0.01),并且EA組大鼠腦梗死容積顯著降低,優(yōu)于MCAO組(P<0.001)。
　　缺血2h再灌注6h后EA組較MCAO組和Sham組pSTAT3(Ser727)表達(dá)量顯著升高(P<0.001)。再灌注24h后EA組和MCAO組中pSTAT3(Ser727)表達(dá)量較Sham組顯著升高(P<0.05),但EA組和MCAO組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

13、異。
　　免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示,缺血再灌注損傷后pSTAT3(Ser727)主要表達(dá)于NeuN陽性的神經(jīng)元內(nèi),胞漿和胞核內(nèi)都有表達(dá)。
　　2.STAT3活化抑制劑PpYLKTK對電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)的影響
　　電針后1.5h給予STAT3活化抑制劑PpYLKTK可以顯著下調(diào)EA組大鼠缺血再灌注6h后pSTAT3(Ser727)的表達(dá)水平(P<0.001)。
　　PpYLKTK可以部分逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng)

14、,缺血2h,再灌注72h后,EA組神經(jīng)行為學(xué)評分顯著優(yōu)于MCAO組以及EA+Pp組(P<0.001),并且腦梗死容積也顯著小于MCAO組以及EA+Pp組(P<0.001)。
　　3.STAT3磷酸化水平的變化對缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
　　PpYLKTK能夠增加缺血腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡數(shù)量,缺血2h,再灌注24h后,EA組大鼠腦缺血再灌注損傷組織中Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于EA+Pp組和MCAO組(P<0.

15、01),同時(shí)active-caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)也低于EA+Pp組和MCAO組(P<0.05)。
　　缺血2h,再灌注24h后,MCAO組大鼠BAX/Bcl-2比值較Sham組顯著升高,電針組較MCAO組明顯降低,而EA+Pp組較EA組則明顯上調(diào)Bax/Bcl-2比值。
　　4.電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)中對下游STAT3分子磷酸化的調(diào)控機(jī)制
　　缺血2h再灌注6h后EA+CB1-siRNA和EA+AM251組pSTA

16、T3(Ser727)表達(dá)量較EA和EA+vehicle組降低(P<0.001)。
　　缺血2h再灌注6h后WIN55,212-2組和ACEA組pSTAT3(Ser727)表達(dá)量較MCAO組和MCAO+vehicle組顯著升高(P<0.01)。
　　結(jié)論
　　電針預(yù)處理通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性大麻素受體CB1調(diào)節(jié)下游STAT3分子的磷酸化水平介導(dǎo)缺血再灌注損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用,改善腦缺血再灌注損傷的愈后,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明了