Moesin磷酸化在AGEs介導(dǎo)的小鼠腦及其他器官微血管功能變化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 微血管病變是糖尿病腦血管病并發(fā)癥的病變基礎(chǔ),血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的改變?cè)谔悄虿∥⒀懿∽兊陌l(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用。而血管通透性的增高是糖尿病微血管病變的一個(gè)標(biāo)志性事件,是其發(fā)生的最初表現(xiàn)和導(dǎo)致其他后續(xù)改變的病理基礎(chǔ)。晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)是一組在蛋白質(zhì)的氨基和糖的醛基之間非酶性糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的總稱。在糖尿病微血管病的發(fā)生過(guò)程中,AGEs大量

2、堆積是導(dǎo)致糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要因?yàn)?。本研究通過(guò)利用AGEs刺激的小鼠,利用免疫組織化學(xué)、免疫熒光、蛋白磷酸化檢測(cè)、激酶特異性抑制劑和通透性測(cè)定的方法,在整體水平研究在AGEs引起的腦血管通透性增高中,血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白及其磷酸化在其中的作用,探討AGEs引起moesin改變的上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。對(duì)moesin在AGEs介導(dǎo)的腦微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能變化中作用的闡明,將有助于探討AGEs相關(guān)疾病,特別是糖尿病性腦血管病以及糖尿病性

3、腎病等其他的糖尿病并發(fā)的微血管病的發(fā)病機(jī)制,為臨床防治提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.AGE-MSA的體外制備
　　 將小鼠血清白蛋白(MSA)、葡萄糖(D-Glucose)溶解在磷酸鹽緩沖液PBS(pH7.2,0.4 mol/L)中,再加入青霉素和慶大霉素等。終濃度:葡萄糖0.2 mol/L、MSA 3.5 mg/mL、青霉素90.3 U/mL、慶大霉素0.07 mg/mL、PMSF 50μmol/L、

4、EDTA 0.001 mol/L、疊氮鈉0.001 mol/L?；旌衔镉?.2μm濾器過(guò)濾,放置在37℃,8周。以相同條件但不含葡萄糖的緩沖液孵育的鼠血清白蛋白作為對(duì)照。8周后將混合液用Millipore 15 mL超濾柱濃縮,Pierce Endotoxin Removing Gel去內(nèi)毒素,Millipore 0.22μm濾器除菌。用熒光分光光度法測(cè)定AGEs含量。AGE-MSA中含有AGEs 80.50 U/mg protein,

5、而對(duì)照的天然小鼠血清白蛋白中只含有AGE0.79 U/mg protein。
　　 2.小鼠的實(shí)驗(yàn)分組及處理
　　 符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠120只,10～12周齡,16～20g。
　　 1)實(shí)驗(yàn)小鼠分成四組:對(duì)照組、AGE-MSA組、p38 MAPK抑制組和ROCK抑制組。
　　 2)處理方法:
　　 a.對(duì)照組:每天定時(shí)腹腔注射MSA(10 mg/kg),連續(xù)注射7

6、天。
　　 b.AGE-MSA組:每天定時(shí)腹腔注射AGE-MSA(10 mg/kg),連續(xù)注射7天。
　　 c.p38 MAPK抑制組(SB203580+AGE-MSA):每天定時(shí)腹腔注射p38 MAPK的抑制劑SB203580(1mg/kg),半個(gè)小時(shí)之后,注射AGE-MSA(10 mg/kg)。連續(xù)注射7天。
　　 d.ROCK抑制組(Y27632+AGE-MSA):每天定時(shí)腹腔注射ROCK的抑制劑Y2763

7、2(5 mg/kg),半個(gè)小時(shí)之后,注射AGE-MSA(10 mg/kg)。連續(xù)注射7天。
　　 3.血腦屏障通透性的測(cè)定
　　 將各組C57BL/6小鼠用13.3％氨基甲酸乙酯加0.5％氯醛醣(0.65 ml/kg)肌肉注射麻醉背位固定。從小鼠尾靜脈約10秒鐘內(nèi)注射3％伊文思藍(lán)45 mg/kg。注射后小鼠全身變藍(lán),從而確認(rèn)染料已經(jīng)吸收和分布。伊文思藍(lán)在小鼠體內(nèi)循環(huán)1小時(shí)后,打開(kāi)胸腔,剪開(kāi)右心耳,通過(guò)左心室灌注生理鹽水(

8、灌注壓為110mmHg),直到右心房流出的清亮液體。再通過(guò)左心室灌注預(yù)熱的用PH3.5,0.05mol/L的檸檬酸緩沖液稀釋的1％多聚甲醛(37℃)2 min。EB是一種四鈉重氮染料,在體內(nèi)或體外均可以定量地與白蛋白結(jié)合。EB靜脈注射后,與血漿白蛋白以10:1的比例緊密地結(jié)合在一起。灌注的目的是沖洗血管中含伊文思藍(lán)的血液,清除血管內(nèi)的染料,避免其影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PH值3.5有利于伊文思藍(lán)和白蛋白的結(jié)合,溫暖到37℃可以防止血管收縮。而選用

9、pH3.5,0.05mol/L的檸檬酸緩沖液稀釋的1％多聚甲醛緩沖液灌洗是因其與白蛋白結(jié)合更加緊密,更能徹底清除血管內(nèi)殘留的EB。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)勻漿法和冰凍切片兩種方法從定量和定性兩方面進(jìn)行觀察血腦屏障通透性的變化。勻漿法與冰凍切片的腦組織取材來(lái)自于同一小鼠大腦的前后兩個(gè)部位。
　　 勻漿法:灌注后取出大腦,稱量一半腦組織,獲得濕重。將腦組織置于50％的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)2m

10、l中勻漿。勻漿液在4℃下,15000 r/min,離心20min后提取上清液(離心的目的是沉淀蛋白質(zhì),以免影響光密度值的測(cè)定)。以無(wú)水乙醇1:3稀釋上清液后,在熒光分光光度計(jì)620 nm下,測(cè)定熒光值。通過(guò)外標(biāo)準(zhǔn)法計(jì)算每份樣品的EB濃度:校零標(biāo)準(zhǔn)品為50％三氯乙酸按1:3加入無(wú)水乙醇。使用校零標(biāo)準(zhǔn)品配置不同濃度EB標(biāo)準(zhǔn)樣品(31.25ng/ml～2000ng/ml),并作標(biāo)準(zhǔn)曲線(結(jié)果呈線性關(guān)系)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算樣品濃度,定量每份腦組

11、織抽提液的EB量。再與組織的質(zhì)量相比,得到每克腦組織的EB含量。
　　 冰凍切片:灌注后,取一半大腦,快速進(jìn)行冠狀冰凍切片,8μm,隔4取1。避光晾干,用50％甘油-PBS封片。顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光下觀察并拍片。
　　 4.Western Blot檢測(cè)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin及其磷酸化水平
　　 將小鼠麻醉后作打開(kāi)顱腔,取腦,冰上去除軟腦膜和白質(zhì)。將剩余腦組織放入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液中,用組織勻漿

12、機(jī)冰上勻漿共10 min,分三次,每次間隔1分鐘。然后冰上靜置裂解60min,離心取上清,采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后采用Tris/甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡法獲得印跡膜,將用二抗結(jié)合后的印跡膜放入TBST中漂洗3×5 min后,濾紙小心吸干膜上液體,在膜上加適量配制好的ECL發(fā)光底物(Amersham,美國(guó)),使其于印跡膜充分作用接觸,吸去多余液體,于柯達(dá)2000工作站曝光顯影保存。
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13、.免疫組化分析各器官組織血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin及其磷酸化水平
　　 將小鼠各器官組織取出,經(jīng)固定后石蠟包埋、切片、脫蠟水化、抗原修復(fù)后采用兩步法檢測(cè)各器官組織血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白及其磷酸化的水平,在400倍光鏡下觀察并拍片。利用Leaca Q500MC軟件獲取灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　 6.免疫熒光分析腦血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin及其磷酸化水平
　　 將小鼠各器官組織取出,經(jīng)固定后石蠟包埋、切片、脫蠟水化、

14、抗原修復(fù)后,用熒光二抗進(jìn)行孵育檢測(cè)各器官組織血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白及其磷酸化的水平,在1000倍油鏡下觀察、拍片。利用Leaca Q500MC軟件獲取灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　 結(jié)論:
　　 1.AGEs可引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin的磷酸化,導(dǎo)致腦微血管通透性增加,表明糖尿病腦微血管病變中AGEs可能起著重要作用。
　　 2.p38 MAPK和ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了AGEs介導(dǎo)的moesin的磷酸化