磷酸化南極磷蝦肽增加骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨密度及其作用機(jī)制研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性和骨折發(fā)生率增高的全身性骨病。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是骨質(zhì)疏松癥中最為常見(jiàn)的類型，它的顯著特征表現(xiàn)為高骨轉(zhuǎn)換型，即骨吸收與骨生成均處于活躍狀態(tài)。目前全世界2億多骨質(zhì)疏松癥患者中約有33％為絕經(jīng)后婦女，而治療骨質(zhì)疏松癥的藥物副作用較大，因此需要尋找安全有效的抗骨質(zhì)疏松活性物質(zhì)。南極磷蝦含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，蛋白質(zhì)磷酸化是提高蛋白質(zhì)功能的一種有效手段，磷酸基的導(dǎo)入會(huì)促進(jìn)生物體對(duì)鈣的吸收，但對(duì)于磷酸

2、化蛋白改善骨質(zhì)疏松的研究尚無(wú)報(bào)道。從南極磷蝦蛋白中制備的南極磷蝦肽具有多種生物活性，但關(guān)于磷酸化南極磷蝦肽（phosphorylated peptides from Antarctic krill，PP-AKP）在抗骨質(zhì)疏松活性方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本論文采用雙側(cè)去卵巢手術(shù)建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，系統(tǒng)研究了PP-AKP對(duì)骨質(zhì)疏松癥的改善作用，并闡明了其可能的作用機(jī)制，主要研究結(jié)果如下:
　　從南極磷蝦中制備的PP-AKP，其分

3、子量范圍為200-2000Da，蛋白含量為90.71％，磷含量為1.52％，氟含量為2.49ppm（符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）。模型大鼠灌胃PP-AKP90d后，其血液、尿液生化指標(biāo)結(jié)果顯示，PP-AKP能顯著降低模型大鼠血清中BALP活性和OCN、PICP含量，增加OPG含量，降低RANKL含量，降低RANKL/OPG比值，調(diào)控模型大鼠骨生成，抑制高骨轉(zhuǎn)換速率，抑制骨吸收;PP-AKP能顯著降低血清中TRACP、Cath-K活性和CTX-

4、1含量，降低尿液中DPD、Ca、P含量，抑制模型大鼠骨吸收，抑制膠原和礦物質(zhì)的丟失。炎癥因子能通過(guò)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞，介導(dǎo)骨吸收。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PP-AKP能顯著降低模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、NO含量和COX-2活性，抑制模型大鼠骨吸收。提示PP-AKP能顯著抑制模型大鼠的高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，抑制骨吸收。
　　骨密度是診斷骨質(zhì)疏松癥的金指標(biāo)。骨生物力學(xué)是全面評(píng)價(jià)骨質(zhì)量，預(yù)測(cè)骨折發(fā)生的關(guān)鍵指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)

5、果顯示，PP-AKP能顯著增加模型大鼠股骨和脛骨骨密度，增加模型大鼠脛骨最大載荷和結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，提高生物力學(xué)性能。股骨組織學(xué)分析進(jìn)一步顯示，PP-AKP能顯著增加骨小梁數(shù)目，增加骨小梁面積，降低骨小梁間距，修復(fù)骨組織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，維持較高的骨連接。提示PP-AKP能提高模型大鼠的骨強(qiáng)度，減少骨折發(fā)生。
　　成骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松中起關(guān)鍵作用，它不僅介導(dǎo)骨生成，而且調(diào)控破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。其中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路是成骨細(xì)胞

6、介導(dǎo)骨生成的主要通路。qRT-PCR結(jié)果顯示，PP-AKP能顯著下調(diào)模型大鼠股骨Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵基因LRP-5b、β-catenin、RUNX2、OSX mRNA的表達(dá)，顯著下調(diào)COLⅠ、OCN、ALP等成骨細(xì)胞功能相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，pP-AKP能顯著抑制模型大鼠股骨LRP-5b、總β-catenin、核β-catenin、RUNX2等蛋白的表達(dá)。提示PP-AKP通過(guò)下調(diào)W

7、nt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)控模型大鼠的骨生成，抑制模型大鼠高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)。
　　OPG/RANKL/RANK通路在成骨細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞活性和功能方面起重要作用。NF-κB和MAPKs信號(hào)通路的激活是OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路傳遞的特征標(biāo)志。qRT-PCR結(jié)果顯示，PP-AKP能顯著上調(diào)模型大鼠股骨OPG mRNA的表達(dá)，顯著下調(diào)RANKL mRNA的表達(dá)，對(duì)RANK mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響;顯著下調(diào)NF-κB通

8、路中關(guān)鍵基因TRAF6、NF-κB、c-fos和NFATC1 mRNA的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，PP-AKP能顯著上調(diào)模型大鼠股骨OPG的蛋白表達(dá)，顯著下調(diào)RANKL、TRAF6、NFATC1的蛋白表達(dá)，顯著下調(diào)p-NF-κB的蛋白表達(dá)水平，但對(duì)NF-κB總蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響。提示PP-AKP能抑制OPG/RANKL/NF-κB信號(hào)通路的激活。另外，PP-AKP顯著下調(diào)MAPKs通路中p38、ERK、JNK等mRNA的

9、表達(dá)，顯著下調(diào)p-p38的蛋白表達(dá)，但對(duì)p38總蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響。提示PP-AKP能抑制OPG/RANKL/MAPKs信號(hào)通路的激活。Cath-K、MMP-9和TRACP是破骨細(xì)胞吸收功能的標(biāo)志性指標(biāo)。結(jié)果顯示，PP-AKP能顯著抑制Cath-K、MMP-9和TRACP mRNA的表達(dá)，顯著抑制Cath-K和MMP-9蛋白的表達(dá)。綜上結(jié)果顯示，PP-AKP能通過(guò)抑制OPG/RANKL/NF-κB和OPG/RANKL/MAPKs信號(hào)通