花生抗黃曲霉iso-ARah3基因的克隆及功能研究.pdf

1、黃曲霉毒素是由真菌類的黃曲霉和寄生曲霉侵染易感宿主后產(chǎn)生的一類真菌毒素，普遍存在于土壤、農(nóng)作物及各種食品中，進(jìn)而危害動物和人類的生命健康，被認(rèn)為是最嚴(yán)重的食品安全問題之一。花生是受黃曲霉菌侵染和黃曲霉毒素危害最為嚴(yán)重的作物，已成為全球花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。目前，國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為解決花生黃曲霉毒素的污染最經(jīng)濟(jì)有效的可行途徑是通過基因工程手段培育抗性品種。通過研究花生抗黃曲霉機(jī)制，挖掘抗性相關(guān)基因和標(biāo)記，利用基因工程技術(shù)培育農(nóng)藝性狀

2、優(yōu)良的抗性花生新品種。本研究室前期通過差異蛋白質(zhì)組和基因組研究發(fā)現(xiàn)，收獲前干旱脅迫及黃曲霉侵染下，抗-感黃曲霉花生資源間存在一些差異表達(dá)基因，其中iso-ARah3基因在干旱及黃曲霉脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)差異最顯著，推測其在花生抗黃曲霉反應(yīng)中有重要作用，對其直接的分子功能及抗黃曲霉反應(yīng)中作用機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。
　　在前期的研究基礎(chǔ)上，本論文：1)通過表達(dá)基因芯片對抗（Y20）-感（H23）花生品種進(jìn)行誘導(dǎo)差異分析，篩選出1-2個顯著響

3、應(yīng)黃曲霉相關(guān)基因，對其進(jìn)行熒光定量PCR檢測和時(shí)空表達(dá)特性分析；2）通過PCR克隆獲得iso-ARah3基因全長，進(jìn)行生物信息學(xué)分析；構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的體外表達(dá)與純化；通過免疫兔子，制備多克隆抗體，并對iso-ARah3蛋白質(zhì)的組織表達(dá)進(jìn)行WesternBlot檢測；3）通過克隆將iso-ARah3基因轉(zhuǎn)入植物超表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將含有iso-ARah3基因的陽性載體轉(zhuǎn)化到花生中進(jìn)行體內(nèi)超表達(dá)分析；4）利用基因組

4、步行技術(shù)從花生基因組DNA中克隆iso-ARah3基因上游啟動子序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　主要獲得以下研究結(jié)果：
　　1.利用表達(dá)基因芯片技術(shù)，比較抗-感花生品種在收獲前干旱及黃曲霉處理?xiàng)l件下基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)抗性品種（Y20）中iso-ARah3基因在干旱及黃曲霉脅脅迫處理下表達(dá)量顯著上調(diào)，結(jié)果證明花生iso-ARah3基因在某種程度上參與了抗性品種抗黃曲霉侵染。采用熒光定量PCR進(jìn)行時(shí)空、組織誘導(dǎo)表達(dá)分析，得出該

5、基因表達(dá)水平隨著種子的不同發(fā)育時(shí)期有所不同，在種子剛剛發(fā)育時(shí)其表達(dá)量最高。在花生的不同組織中，該基因的表達(dá)量也不相同，分別對花生葉、根、花蕾、花、莖中該基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，該基因在在花中沒有表達(dá)，在葉、花蕾中的表達(dá)量相同，莖中的表達(dá)量是葉、花蕾中的6倍，在根中該基因具有很高的表達(dá)量是葉、花蕾中表達(dá)量的200多倍。該基因在受到不同病害脅迫下，表達(dá)的模式也不相同。在受到銹病感染時(shí)，其表達(dá)量為零。與正常葉片相比，受到葉斑病侵染，其表達(dá)量上調(diào)

6、，受到花葉病侵染條件下，該基因的表達(dá)量上調(diào)最為顯著。
　　2.以cDNA為模板，通過PCR技術(shù)克隆該基因全長，生物學(xué)信息學(xué)分析表明，該基因具有1531bp的開放讀碼框，編碼510個氨基酸。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白含有8個α-螺旋和22個β-折疊，序列含有2個Cpuin-1的相對保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域，屬于cupin蛋白超家族。通過同源序列比對，表明測序所獲得基因序列與NCBI公布的序列有兩處堿基序列不同，構(gòu)建pET28a-isoARah3原

7、核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達(dá)后經(jīng)鎳柱親和層析，獲得大小約為54kD的原核表達(dá)融合蛋白。對其體外功能研究表明，融合蛋白具有體外抑菌的功能，但作用效果不是很明顯。抗體制備經(jīng)WesternBlot檢測制備成功，且純度為84.5％。以含iso-ARah3基因的抗體為一抗，對花生種子、胚、和子葉時(shí)期的總蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡雜交試驗(yàn)，花生種子、胚、子葉均在相應(yīng)位置出現(xiàn)了雜交信號，且花生種子出現(xiàn)的條帶豐度最高，在翻譯的水平進(jìn)一步檢測了iso-

8、ARah3基因的表達(dá)。
　　3.以PCAMBIA1301為雙元表達(dá)載體，通過雙酶切分別插入啟動子35S和目的基因iso-ARah3，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化，侵染植物種子后進(jìn)行該基因的植物表達(dá)。獲得花生植株后，提取植株的DNA，經(jīng)潮霉素抗性篩選結(jié)果表明獲得了7株擬轉(zhuǎn)基因花生植株。為進(jìn)一步了解iso-ARah3基因的在花生中的功能及調(diào)控表達(dá)機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)。
　　4.以酶切構(gòu)建的DNA庫為模板，利用巢式PCR法成功克隆