維生素D在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的:膿毒癥所致急性呼吸窘迫綜合征(acuterespirarorydistresssyndrome,ARDS)為臨床常見危重癥,肺泡上皮細(xì)胞損傷是其主要病理改變之一。研究顯示維生素D除具有經(jīng)典的調(diào)節(jié)鈣磷平衡作用外,還具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等廣泛的骨外生物學(xué)效應(yīng)。目前有關(guān)維生素D在組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞,特別是膿毒癥時(shí)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolarepithelialcelltypeⅡ,ATⅡ)中干預(yù)作用的研究相對(duì)少見。本研究選取人ATⅡ細(xì)胞系

2、A549為研究對(duì)象,以脂多糖為刺激因素,探究維生素D對(duì)ATⅡ炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制,為臨床防治膿毒癥型ARDS提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.以體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞為研究對(duì)象,首先,按照對(duì)照組、LPS刺激組(1μg/ml)、LPS+25(OH)D3(100nmol/L)干預(yù)組、LPS+1α,25(OH)2D3(100nmol/L)干預(yù)組、25(OH)D3(100nmol/L)干預(yù)組、1α,25(OH)2D3(10

3、0nmol/L)干預(yù)組分組;再次,按照1α,25(OH)2D3(100nmol/L)的不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)(LPS刺激前24小時(shí)、LPS刺激前16小時(shí)、LPS刺激前6小時(shí)、LPS刺激前3小時(shí)、同時(shí)給藥、LPS刺激后3小時(shí)、LPS刺激后6小時(shí))分組;最后,按照1α,25(OH)2D3的不同給藥濃度(10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L)分組;以LPS的給藥時(shí)間為起點(diǎn),24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。另外,給予1α,25(OH)2D3

4、(1μmol/L)干預(yù),分別于LPS刺激6小時(shí)、12小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子白介素(interleukin,IL)-8的表達(dá)水平。
　　2.按照對(duì)照組、LPS刺激組(1μg/ml)、LPS+1α,25(OH)2D3(10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L)干預(yù)組分組;于LPS刺激A549細(xì)胞24小

5、時(shí)后應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。
　　3.應(yīng)用免疫組化、免疫熒光方法檢測(cè)人正常肺組織中ATⅡ及A549細(xì)胞維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)、1α-羥化酶(CYP27B1)的表達(dá)分布。
　　4.按照對(duì)照組、LPS刺激組、LPS+1α,25(OH)2D3(1μmol/L)干預(yù)組、1α,25(OH)2D3(1μmol/L)干預(yù)組分組,在LPS刺激30分鐘和24小時(shí)后收集細(xì)胞提取總蛋白,應(yīng)用WesternB

6、lot方法檢測(cè)NF-κBp65、IκB-α蛋白的表達(dá)水平;應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)NF-κBp65的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果:
　　1.1α,25(OH)2D3可顯著降低A549細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后炎癥因子IL-8的表達(dá)水平(P<0.05),而25(OH)D3僅輕度降低IL-8的表達(dá)水平,且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;1α,25(OH)2D3在七個(gè)不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)均可顯著降低炎癥因子IL-8的表達(dá)水平(P<0.05),其中在LPS刺激前24小時(shí)給

7、藥最為明顯;三個(gè)不同給藥濃度的1α,25(OH)2D3均可顯著降低炎癥因子IL-8的表達(dá)水平(P<0.05),其中高濃度組最為明顯;1α,25(OH)2D3在LPS刺激后6小時(shí)及12小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可顯著降低炎癥因子IL-8的表達(dá)水平(P<0.05)。
　　2.LPS(1μg/ml)組細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組明顯下降(P<0.05),在LPS刺激前24小時(shí)給予1α,25(OH)2D3(10nmol/L、100nmol/L、1μmol/

8、L)干預(yù)與LPS刺激組比較未顯著影響細(xì)胞增殖活力。
　　3.VDR和CYP27B1在人正常肺組織ATⅡ中均有表達(dá),VDR表達(dá)于胞核和胞漿處,CYP27B1主要表達(dá)于細(xì)胞漿。與正常ATⅡ有所不同,A549細(xì)胞的VDR主要表達(dá)于核膜和胞漿處,并且在A549細(xì)胞中未檢測(cè)到CYP27B1的表達(dá)。
　　4.1α,25(OH)2D3在30分鐘和24小時(shí)可顯著升高A549細(xì)胞和經(jīng)LPS刺激后A549細(xì)胞IκB-α總蛋白的表達(dá)水平,而對(duì)NF

9、-κBp65總蛋白的表達(dá)水平無(wú)顯著影響;免疫熒光檢測(cè)顯示1α,25(OH)2D3可抑制LPS刺激后A549細(xì)胞NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論:
　　1.1α,25(OH)2D3可顯著抑制LPS致傷A549細(xì)胞炎癥因子IL-8的表達(dá),抑制程度隨給藥濃度的增加而增強(qiáng),并且在LPS刺激前24小時(shí)干預(yù)時(shí)其抗炎作用效果最為明顯。
　　2.1α,25(OH)2D3對(duì)LPS致傷A549細(xì)胞的增殖活力無(wú)顯著影響。
　　3.

10、VDR和CYP27B1在人正常肺組織ATⅡ中均有表達(dá),提示正常ATⅡ具有局部合成1α,25(OH)2D3的可能,而A549細(xì)胞僅表達(dá)VDR,未檢測(cè)到CYP27B1的表達(dá),這可能是給予25(OH)D3不能在A549細(xì)胞局部經(jīng)CYP27B1催化為1α,25(OH)2D3,而發(fā)揮抗炎作用的原因之一。
　　4.1α,25(OH)2D3可能通過(guò)上調(diào)IκB-α蛋白的表達(dá),抑制NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而使其下游炎癥因子IL-8的表達(dá)下調(diào),從