GRIM-19及其靶基因產物P-STAT3與人肝細胞肝癌的相關性研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是源自肝細胞的惡性腫瘤，是原發(fā)性肝癌中最常見的一種病理類型，世界上平均每年死于HCC的人數(shù)約有1，250，000，HCC的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因參與的復雜過程。目前針對HCC的治療，主要是外科手術切除病灶或者是通過介入手段進行局部化療栓塞治療，對HCC患者進行放療和全身化療的療效均不理想。隨著分子生物學的發(fā)展，免疫治療和基因治療等生物治

2、療方法作為繼手術、化療、放療之后的第四種治療模式，日益受到重視。
　　 GRIMs(genes associated with retinoid-IFN-induced mortality)是新近由Kalvakolanu在研究干擾素(interferon，IFN)和維甲酸(retinoic acid，RA)合并誘導細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)的一組參與細胞凋亡的基因，共24種，GRIM-19是其中最具代表性的一種。GRIM-19編碼含144個

3、氨基酸殘基的蛋白質，分子量約16KD，定位于19p13.1，是一種保守基因，可以在多種正常組織中表達。目前GRIM-19蛋白的細胞定位存在爭議，有研究認為GRIM-19主要定位于細胞核，也有研究認為GRIM-19主要表達于胞漿中的線粒體。Lufei等則認為GRIM-19的定位因細胞種類不同而存在差異，目前國內外對GRIM-19在肝癌組織中的表達及功能都尚未見報道。研究表明，GRIM-19參與細胞增殖、凋亡的調控過程，該基因表達的降低或者

4、位點的突變可以導致細胞的異常增殖和惡性轉化，GRIM-19在肝細胞癌變的過程中發(fā)揮了怎樣的作用，值得我們深入探討。
　　 GRIM-19可以特異性的與組成性活化的STAT3偶聯(lián)，從而抑制其轉錄活性，并抑制腫瘤生長，對腫瘤治療有巨大的潛在價值。這一機制在腎細胞癌、部分前列腺癌、HPV感染的富頸癌等部分腫瘤組織中都有所報道。但在肝癌方面，只在體外培養(yǎng)的HepG2細胞中有過報道。STAT3可以被多種病毒致癌蛋白所激活，STAT3的組成

5、性活化能促進細胞的惡性轉化并阻斷其凋亡，促進腫瘤細胞的增殖，血管形成，因此，阻斷STAT3的表達對腫瘤的治療具有巨大的潛在價值。深入研究GRIM-19與p-STAT3的關系，探討其對細胞轉化、增殖、凋亡的調控機制，將有利于闡明肝癌的發(fā)生機制。
　　 GRIM-19是由RA和IFNs合并誘導細胞時發(fā)現(xiàn)的參與細胞凋亡的基因。維甲酸是維生素A在體內產生的衍生物，屬于分化誘導劑類，具有逆轉癌前病變，誘導腫瘤細胞分化，提高腫瘤細胞對化療的

6、敏感性等作用;干擾素則通過與細胞表面受體結合，激活包括JAK-STAT途徑、干擾素調節(jié)因子在內的多種信號轉導途徑，直接抑制腫瘤細胞的增殖。在臨床上，單用維甲酸和干擾素治療腫瘤的研究較多，聯(lián)合治療腫瘤的研究比較少，兩藥聯(lián)合對肝癌細胞的影響及其誘導凋亡的機制尚不清楚。目前針對GRIM-19基因的生物學功能及作用機制的研究尚處于起步階段，進一步認識其蛋白的功能、調節(jié)方式及其作用機制，將為深入了解腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展提供新的線索，為腫瘤的診斷、

7、治療提供新的靶點和研究方向。
　　 第一部分：GRIM-19及p-STAT3在人肝細胞肝癌中的表達及臨床意義
　　 研究目的：
　　 1.檢測GRIM-19在原發(fā)性肝細胞肝癌和癌旁組織中的表達及定位。
　　 2.檢測p-STAT3在原發(fā)性肝細胞肝癌和癌旁組織中的表達及定位。
　　 3.分析GRIM-19及其靶基因STAT3、p-STAT3、VEGF在肝癌和癌旁組織中的相關性。
　　 4.分

8、析GRIM-19與原發(fā)性肝癌的病因、病理類型、分化程度等臨床特征的相關性。
　　 研究方法：
　　 1.收集55例手術之前未經任何治療的原發(fā)性肝癌患者的臨床資料及經手術切除的肝細胞癌組織及鄰近的非癌肝組織（鄰近非癌肝組織:肉眼觀正常，且距離腫瘤組織邊緣5cm以上），組織標本于手術切除后盡快采集，經脫水、石蠟包埋后切片，采用免疫組織化學染色法，檢測GRIM-19和p-STAT3在肝癌組織和非癌肝組織中的表達和定位。

9、　　 2.分別提取肝癌及癌旁肝組織的總蛋白和核蛋白，通過WesternBlot的方法檢測GRIM-19蛋白的表達情況。
　　 3.分別提取肝癌及癌旁肝組織的RNA，通過RT-PCR檢測GRIM-19在mRNA水平的表達情況。
　　 4.分別提取肝癌及癌旁肝組織的總蛋白，通過WesternBlot的方法檢測GRIM-19及其靶基因STAT3、p-STAT3、VEGF的表達情況。
　　 5.分析GRIM-19與臨床

10、病理特征的相關性。
　　 結果：
　　 1.免疫組織化學染色結果判讀。
　　 免疫組織化學染色結果由與本研究無關的兩名病理醫(yī)生評定，每張切片觀察5～6個400×視野，計數(shù)不少于100個細胞，依據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)進行分級，染色強度記分為四個等級:陰性:陽性細胞數(shù)少于5％，以“-”表示;弱陽性:陽性細胞數(shù)在5％～25％之間，以“+”表示;中等陽性:陽性細胞數(shù)在25％～50％之間，以“++”表示;強陽性:陽性細胞數(shù)

11、在50％～100％之間，以“+++”表示。
　　 2.GRIM-19在肝細胞癌、非癌肝組織中的表達和定位。
　　 ①免疫組織化學染色結果顯示:在非癌肝組織中，GRIM-19蛋白陽性產物主要分布在細胞質，亦有少量陽性產物分布在細胞核，表現(xiàn)為不同染色程度的黃色或棕黃色顆粒;而在肝細胞癌組織中，GRIM-19陽性產物只存在于細胞質。
　　 ②分別提取肝細胞癌及癌旁組織的核蛋白，Western Blot檢測結果顯示:GR

12、IM-19蛋白在肝癌細胞核蛋白中的表達明顯低于癌旁肝細胞的核蛋白(P＜0.001)。
　　 3.GRIM-19在肝細胞癌和癌旁肝組織中的表達水平。
　　 ①免疫組織化學染色法結果顯示:GRIM-19蛋白在肝細胞癌組織中的表達明顯低于癌旁肝組織。對照組4例正常肝組織中GRIM-19表達陽性的有3例(3/4，75％);55例癌旁肝組織中GRIM-19表達陽性的有40例(40/55，72.7％);而55例肝細胞癌組織中GRIM

13、-19表達陽性的只有25例(25/55，45.5％)。16例不伴隨肝纖維化的癌旁組織中有12例GRIM-19表達陽性(12/16，75％);39例伴隨肝纖維化的癌旁組織中有28例GRIM-19表達陽性(28/39，71.8％)，不伴隨肝纖維化的癌旁組織與伴隨肝纖維化的癌旁組織比較，GRIM-19蛋白的表達無明顯差異(p＞0.05)。GRIM-19在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織(p＜0.05)，甚至表達缺失。另外，65例GRIM-19

14、表達陽性的肝組織中有23例為++～+++（按結果判讀標準分為中等陽性），在這23例中等陽性標本中有20例是癌旁組織(20/23，87％)。
　　 ②Western Blot和RT-PCR檢測，結果進行灰度分析顯示:GRIM-19蛋白在肝細胞癌組織中的表達水平明顯低于鄰近的非癌肝組織(p＜0.001)。普通RT-PCR檢測結果顯示，GRIM-19mRNA在肝細胞癌組織中的表達水平明顯低于鄰近的非癌肝組織(p＜0.001)。QRT-

15、PCR檢測結果顯示，GRIM-19mRNA在肝細胞癌組織中的表達水平約為癌旁組織的1/6～1/2不等。
　　 4.p-STAT3在肝細胞癌、非癌肝組織中的表達及定位。
　　 免疫組織化學染色結果顯示:在肝癌組織中，P-STAT3蛋白陽性產物主要定位在細胞核，多呈散在或灶狀分布;P-STAT3蛋白在肝細胞癌組織中的表達明顯高于癌旁肝組織。55例肝癌組織中p-STAT3表達陽性的有47例(47/55，85.5％)，55例癌旁

16、肝組織中p-STAT3表達陽性的只有14例(14/55，25.5％)。12例組織病理分級為Ⅰ級的肝癌組織中p-STAT3表達陽性的有8例(8/12，66.7％)，43例組織病理分級為Ⅱ～Ⅲ級的肝細胞癌組織中p-STAT3表達陽性的有39例(39/43，90.7％)，39例非癌肝纖維化組織中p-STAT3表達陽性的有14例(14/55，25.5％)，而在16例非癌、非纖維化的肝組織中無p-STAT3的表達陽性者。在61例p-STAT3表達

17、陽性的病例中有40例染色為++～+++（按結果判讀標準為中等陽性，40/61，65.6％），在這40例中等陽性的病例中有35例為肝癌組織(35/40，87.5％)。
　　 5.GRIM-19與p-STAT3在原發(fā)性肝細胞肝癌及癌旁組織中表達的相關性。
　　 提取55例患者肝癌及癌旁組織的總蛋白，通過WesternBlot檢測了GRIM-19和p-STAT3蛋白的表達情況，條帶經灰度值分析，檢測結果經配對t檢驗分析顯示:肝

18、細胞癌組織中GRIM-19/β-actin灰度比值(0.29±0.18)明顯低于癌旁組織(0.61±0.11)(p＜0.05)，p-STAT3/β-actin的灰度比值，肝細胞癌中(0.94±0.36)明顯高于癌旁組織(0.23±0.12)(p＜0.05)，兩者經Pearson相關檢驗，相關系數(shù)r=-0.59，表明肝細胞肝癌組織中GRIM-19蛋白的表達與p-STAT3蛋白的表達呈負相關，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　

19、 6.GRIM-19、p-STAT3、STAT3及VEGF在原發(fā)性肝細胞肝癌及癌旁組織中的表達。
　　 隨機抽取了20例患者肝癌及癌旁組織，提取總蛋白，通過WesternBlot檢測GRIM-19、p-STAT3、STAT3以及p-STAT3的下游蛋白VEGF的表達情況，條帶經灰度值分析，檢測結果經配對t檢驗分析顯示:肝癌組織中GRIM-19/β-actin灰度比值(0.28±0.12)明顯低于癌旁組織(0.64±0.21)(p

20、＜0.05);肝細胞肝癌中p-STAT3/β-actin的灰度比值(0.92±0.27)明顯高于癌旁組織(0.31±0.14)(p＜0.05)，與前期得出的實驗結果一致。肝癌組織中STAT3/β-actin灰度比值(0.85±0.13)明顯高于癌旁組織(0.32±0.15)(p=0.008);肝細胞肝癌中VEGF/β-actin灰度比值(0.79±0.21)也明顯高于相應的癌旁肝組織(0.36±0.20)(p=0.012)。
　　

21、 7.肝細胞癌組織中GRIM-19mRNA的表達水平與臨床病理特征的相關性。
　　 肝細胞癌組織中GRIM-19的表達水平與肝癌組織病理分級呈負相關(p=0.001)、血管侵襲呈負相關(p=0.032)、與臨床分期呈負相關(p=0.024);而與年齡、性別、HBV感染、甲胎蛋白(Serumα-fetoprotein)、纖維化水平、腫瘤大小、淋巴結轉移等其他臨床病理特征無相關性。
　　 結論：
　　 1.在正常肝

22、組織中，GRIM-19主要分布在細胞質，少量分布在細胞核;在肝癌組織中GRIM-19表達明顯低于癌旁組織，并且出現(xiàn)核表達缺失。
　　 2.在肝癌及癌旁組織中，p-STAT3主要分布在細胞核，p-STAT3在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織。
　　 3.肝細胞肝癌組織中GRIM-19蛋白的表達與p-STAT3蛋白的表達呈明顯的負相關。
　　 4.肝細胞癌組織中GRIM-19的表達水平與肝癌組織病理分級、血管侵襲

23、、與臨床分期呈負相關;而與年齡、性別、HBV感染、甲胎蛋白、纖維化水平、腫瘤大小、淋巴結轉移等其他臨床病理特征無相關性。
　　 第二部分：全反式維甲酸聯(lián)合干擾素β對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞增殖、凋亡及GRIM-19分子表達的影響
　　 研究目的：
　　 1.檢測GRIM-19在不同的肝癌細胞株中的表達情況。
　　 2.探討維甲酸和干擾素β對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡的影響。
　　 3.探討維甲酸和干

24、擾素β對肝癌細胞HepG2GRIM-19表達的影響。
　　 4.檢測維甲酸和干擾素β對肝癌細胞HepG2GRIM-19的靶基因STAT3、p-STAT3及VEGF表達水平的影響。
　　 研究方法：
　　 1.取傳代培養(yǎng)的肝癌細胞株HepG2、MHCC-97H，同時以正常肝細胞株LO2作對照，檢測三種細胞株中內源性的GRIM-19的表達情況。
　　 2.取傳代培養(yǎng)的HepG2細胞，實驗組加入不同濃度的干擾素

25、β(interferon-β，IFN-β)和維甲酸(retinoic acid，RA)，同時設空白對照組，培養(yǎng)不同的時間(24h、48h和72h)，通過MTT法檢測細胞增殖變化，找到干擾素β和維甲酸抑制肝癌細胞增殖的最適合的濃度和時間。
　　 3.取傳代培養(yǎng)的HepG2細胞，根據(jù)MTT的結果選擇適宜的作用時間，加入不同濃度的維甲酸和干擾素β，流式細胞儀檢測維甲酸和干擾素β對細胞凋亡的影響。
　　 4.取傳代培養(yǎng)的HepG

26、2細胞，根據(jù)MTT的結果選擇適宜的作用時間，加入不同濃度的維甲酸和干擾素β，通過免疫熒光染色比較維甲酸和干擾素β對HepG2細胞中GRIM-19表達的影響。通過Western Blot分別檢測實驗組和對照組細胞總蛋白和核蛋白中GRIM-19表達水平的變化。
　　 5.Western Blot檢測實驗組和對照組GRIM-19的靶基因STAT3、p-STAT3及VEGF的表達變化。
　　 結果：
　　 1、GRIM-

27、19在不同的肝癌細胞株中的表達
　　 1)免疫熒光檢測結果顯示:正常人肝細胞株LO2及肝癌細胞株HepG2和MHCC-97H中均有內源性GRIM-19的表達，其陽性產物主要定位在細胞質，此外，正常人肝細胞LO2亦有少量陽性產物分布于細胞核內，而肝癌細胞株HepG2和MHCC-97H則無細胞核表達，這一結果與前期肝癌及癌旁組織中GRIM-19蛋白的表達定位一致。另外，肝細胞株LO2中GRIM-19的熒光強度明顯高于肝癌細胞株Hep

28、G2和MHCC-97H。
　　 2)通過WesternBlot檢測內源性GRIM-19蛋白在正常人肝細胞株LO2及肝癌細胞株HepG2和MHCC-97H中的表達水平，結果顯示:內源性的GRIM-19蛋白在正常人肝細胞株LO2中表達水平最高，在肝癌細胞株MHCC-97H中表達水平最低，在肝癌細胞株HepG2的表達水平介于LO2細胞和MHCC-97H細胞之間，三組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。而STAT3、p-STAT

29、3和VEGF蛋白在三種細胞株中的表達，則以MHCC-97H細胞最高，LO2細胞最低，HepG2細胞介于LO2細胞和MHCC-97H細胞之間，三組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。
　　 3)通過RT-PCR檢測內源性GRIM-19mRNA在正常人肝細胞株LO2及肝癌細胞株HepG2和MHCC-97H中的表達水平，結果與WesternBlot檢測結果一致:GRIM-19mRNA在正常人肝細胞LO2中表達水平最高，在肝癌細

30、胞MHCC-97H中表達水平最低，而在肝癌細胞HepG2中的表達水平介于LO2細胞和MHCC-97H細胞之間，三組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。
　　 2、不同濃度的IFN-β及從單獨或共同作用對HepG2細胞的增殖抑制
　　 MTT結果顯示:不同濃度的IFN-β、RA單獨或聯(lián)合加入肝癌細胞株HepG2的培養(yǎng)液中，對HepG2細胞的增殖均有一定程度的抑制作用，并且呈明顯的濃度依賴性和作用時間相關性。此外，聯(lián)

31、合用藥比單獨用藥對細胞增殖的抑制作用更強，聯(lián)合用藥組對HepG2細胞的增殖抑制率分別與相同濃度相同作用時間的單獨用藥組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。我們同時發(fā)現(xiàn)IFN-β/RA聯(lián)合用藥濃度過大或作用時間過長均對HepG2細胞有毒性反應，在IFN-β4500u/ml+RA9μmol/L聯(lián)合作用組和所有72h組均觀察到較多的死亡細胞，而在IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L聯(lián)合作用48h組未看到明顯的死亡細胞。因此，

32、在以下實驗中，我們選擇采用IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L作為最佳干預濃度，48h作為最佳干預時間進行實驗。
　　 3、IFN-β/RA聯(lián)合用藥可促進HepG2細胞凋亡
　　 流式細胞儀檢測結果顯示:不同濃度的IFN-β+RA聯(lián)合加入肝癌細胞株HepG2的培養(yǎng)液中作用48h時，HepG2細胞凋亡指數(shù)隨藥物濃度的增加而增加，對照組HepG2細胞的凋亡指數(shù)平均為4.27±1.02，IFN-β500u/ml+RA

33、1μmol/L共同作用48h組，HepG2細胞凋亡指數(shù)平均為9.32±1.16;IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L共同作用48h組，HepG2細胞凋亡指數(shù)平均為16.34±2.71;IFN-β4500u/ml+RA9μmol/L共同作用48h組，HepG2細胞凋亡指數(shù)平均為39.61±6.55。四組凋亡指數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計學意義((P)＜0.05）;三個處理組分別與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義((P)＜0.05）。

34、r>　　 4、IFN-β/RA可誘導HepG2細胞內源性GRIM-19表達增加，并出現(xiàn)GGRI-19的核表達陽性
　　 1)細胞免疫熒光檢測HepG2細胞在IFN-β/RA作用前后GRIM-19蛋白的表達變化，結果顯示:對照組HepG2細胞中GRIM-19蛋白主要定位于細胞質，無細胞核表達;而IFN-β/RA處理組除了細胞體積增大外，出現(xiàn)GRIM-19的核表達陽性，GRIM-19熒光強度比對照組明顯增強，并且隨IFN-β/RA

35、濃度增加，GRIM-19蛋白的熒光強度逐漸增強。
　　 2)收集經IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L作用48h后的HepG2細胞分別提取總蛋白和核蛋白，通過Western Blot檢測了GRIM-19蛋白的表達情況，條帶經灰度值分析，檢測結果經t檢驗分析顯示:實驗組總蛋白中GRIM-19/β-actin灰度比值(1.36±0.37)明顯高于對照組（0.78±0.21）(p＜0.01);實驗組核蛋白中GRIM-19/β

36、-actin灰度比值（0.56±0.19）亦明顯高于對照組(0.14±0.05)(p＜0.01)。
　　 3)收集經IFN-β/RA處理后的HepG2細胞抽提mRNA行RT-PCR檢測，結果顯示:IFN-β500u/ml+RA1μmol/L作用48h時，GRIM-19mRNA表達較對照組增加，約為對照組的1.8倍;當IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L作用48h時，GRIM-19mRNA表達約為對照組的3.9倍;當IF

37、N-β4500u/ml+RA9μmol/L作用48h時，GRIM-19mRNA表達程度最高，約為對照組的5.7倍。
　　 5、實驗組GRIM-19的表達增加伴隨p-STAT3、STAT3、VEGF的表達下降
　　 收集經不同濃度的IFN-β/RA作用48h的HepG2細胞提取總蛋白行Western Blot檢測，條帶經灰度值分析，檢測結果顯示:實驗組GRIM-19的表達水平均高于對照組(p＜0.05)，并且GRIM-19

38、的表達量隨藥物濃度的增加而增加;而p-STAT3、STAT3、VEGF蛋白在實驗組中的表達均明顯低于對照組(p＜0.05)，并且表達水平隨藥物濃度的增加而降低。
　　 結論：
　　 1.內源性GRIM-19在正常肝細胞株及肝癌細胞株中表達和定位不同。
　　 2.IFN-β和RA聯(lián)合作用可抑制肝癌細胞HepG2增殖，促進其凋亡;同時，還可誘導肝癌細胞內源性GRIM-19的表達，下調p-STAT3介導的VEGF的表達