載端粒酶ASODN-t的殼聚糖納米粒的制備和對肝癌HepG-2細胞的轉染.pdf

1、目的：優(yōu)化實驗條件，制備合適的殼聚糖納米粒，并連接上pEGFP-C<,1>質粒，研究殼聚糖納米粒對DNA的結合和保護能力，利用培養(yǎng)的HepG-2細胞進行轉染，評估其轉染性，比較殼聚糖納米粒與陽離子脂質體的轉染率。再連接上端粒酶ASODN-t，轉染HepG-2細胞，對比陽離子脂質體介導的轉染，分別觀察HepG-2細胞的凋亡情況。 方法： 以離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒，并送激光微粒度儀及掃描電子顯微鏡檢測，了解粒徑的分布和形

2、態(tài)；通過靜電吸附作用連接上增強型綠色熒光蛋白表達質粒pEGFP-C<,1>(報告基因)；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析載體與DNA結合力，并通過紫外分光光度計檢測其載藥量和包埋率；紫外分光度計法，檢測納米粒體外釋放pDNA；通過DNase Ⅰ消化實驗，檢測殼聚糖納米粒對DNA的保護作用；以陽離子脂質體為對照，利用培養(yǎng)的HepG-2細胞進行轉染，通過熒光顯微鏡觀察其基因轉染的可行性并比較其轉染效率。連接上端粒酶ASODN-t，以陽離子脂質體為對照，

3、利用培養(yǎng)的HepG-2細胞進行轉染。通過倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細胞生長狀況及凋亡情況；通過DNA抽提及電泳，檢測細胞的凋亡帶；通過流式細胞儀檢測凋亡率，并比較其凋亡率；通過MTT法，描繪出生長曲線；通過 TRAP-ELISA法，測定端粒酶活性。 結果： 1．微粒度儀及電鏡檢測證實殼聚糖納米粒呈均勻分散的球形顆粒，最小粒徑50nm，d(0.5)∶95nm。 2．瓊脂糖凝膠電泳結果顯示殼聚糖納米粒能有效結合增強型綠

4、色熒光蛋白表達質粒pEGFP-C<,1>。紫外分光光度計檢測不同比例結合(納米粒：質粒)pEGFP-C<,1>質粒的殼聚糖納米粒的包埋率分別為：100％(50∶10)，100％(50∶25)，100％(50∶50)，(92±2．3)％(50∶75)，(69±2．2)％(50∶100)。 3．納米粒體外釋放pDNA實驗的結果顯示：殼聚糖納米粒釋藥包括較快釋放和平緩釋放兩個過程。在1-72h即釋藥達總量的(75.4±1.8)％，為較

5、快釋放過程。在72-168h釋放較為緩慢，釋藥達總量的(94.6±1.4)％為平緩釋放過程。 4．DNase Ⅰ消化實驗的結果顯示：未加納米粒及按5∶50的比例加入納米粒處理的，在凝膠上無明顯的DNA條帶；而按50∶50，100∶50的比例處理的，均顯示明顯的DNA條帶，顯示殼聚糖納米粒在此種比例下有良好的DNA保護作用。 5．熒光顯微鏡檢測顯示：用連接上pEGFP-C<,1>質粒的殼聚糖納米粒30ul去轉染時的轉染率(

6、58.6±2.6)％高于Lipofectamin的轉染率(45.5±2.5)％，經(jīng)統(tǒng)計有顯著性差異。 6．透射電鏡觀察顯示：以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導的端粒酶ASODN-t轉染的HepG-2細胞均有發(fā)生凋亡樣改變的細胞。 7．DNA抽提及電泳顯示：以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導的端粒酶ASODN-t轉染的HepG-2細胞均有凋亡帶。 8．流式細胞學檢測的結果顯示：殼聚糖納米

7、粒介導的的凋亡率大于Lipofectamin介導的凋亡率，有顯著差異。 9．對細胞抑制作用的觀察顯示：以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導的端粒酶ASODN-t轉染的HepG-2細胞生長緩慢，其中以殼聚糖納米粒介導的細胞生長更為緩慢，有顯著差異。 10．TRAP-ELISA法測定端粒酶活性的結果顯示：以殼聚糖納米粒(或Lipofectamin)介導的端粒酶ASODN-t轉染72h的HepG-2細胞的端粒酶活性