HOXA5對(duì)體外及體內(nèi)培養(yǎng)的器官樣表皮增殖、分化、分層的調(diào)控研究.pdf

1、同源異形框基因(HOX genes)對(duì)成體表皮的更新具有重要調(diào)控作用,其調(diào)控機(jī)制模擬了胚胎發(fā)育模式。其中HOXA5就是一個(gè)重要的發(fā)育調(diào)控因子。然而關(guān)于HOXA5在皮膚生理學(xué)中的作用究竟是促進(jìn)增殖還是抑制增殖,至今仍存在著爭(zhēng)議。
　　目的:本課題通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染和器官樣表皮構(gòu)建的方法,明確HOXA5對(duì)表皮細(xì)胞增殖和表皮生長(zhǎng)的調(diào)控作用。
　　方法:(1)構(gòu)建野生型HOXA5和同源結(jié)構(gòu)域缺失的突變型HOXA5的慢病毒載體,

2、將其轉(zhuǎn)染人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT。通過(guò)cck-8增殖試驗(yàn)和流式分析,觀察兩者對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。并用Annexin V檢測(cè)各轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的凋亡情況。(2)將各轉(zhuǎn)染細(xì)胞株氣液培養(yǎng)2周,形成三維表皮結(jié)構(gòu)。HE染色觀察其組織形態(tài)。PCNA和TUNEL染色了解表皮細(xì)胞增殖和凋亡情況。免疫熒光染色檢測(cè)分化標(biāo)記物keratin5、keratin10、involucrin、filaggrin表達(dá),觀察HOXA5及其突變體對(duì)器官樣表皮形成

3、和分化的影響。(3)將器官樣表皮移植入裸鼠體內(nèi),每周取材,連續(xù)四周,觀察各移植物組織形態(tài)學(xué)的動(dòng)態(tài)變化并檢測(cè)表皮分子標(biāo)記物表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)染了野生型HOXA5的HaCaT、細(xì)胞增殖速率降低,G1期細(xì)胞比例顯著增加,G1-S期進(jìn)程受阻滯,細(xì)胞早期和晚期凋亡率明顯升高。而轉(zhuǎn)染了突變型HOXA5的HaCaT細(xì)胞則呈現(xiàn)相反表現(xiàn)。(2)野生型HOXA5構(gòu)建的器官樣表皮形態(tài)紊亂,有大量空泡形成,角化層缺失,細(xì)胞失去極性,類(lèi)似于細(xì)胞因子

4、缺失的表皮形態(tài)。同時(shí)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞比例減少,凋亡細(xì)胞比例上升。表皮基底層標(biāo)記物Keratin5表達(dá)缺失,但基底層上分化相關(guān)的keratin10、involucrin、filaggrin表達(dá)略有增強(qiáng)。而突變型HOXA5構(gòu)建的器官樣表皮形態(tài)良好,PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率增加且凋亡細(xì)胞率減少,各分子標(biāo)記物表達(dá)正常。(3)體內(nèi)移植后,由于完善的旁分泌系統(tǒng)作用,野生型HOXA5移植物部分恢復(fù)了正常表皮結(jié)構(gòu),keratin5也重新表達(dá)于基底層,但與對(duì)照