體外培養(yǎng)生精細胞的增殖分化效應及顯微授精研究.pdf

1、第一部分 改良培養(yǎng)基對體外培養(yǎng)生精細胞的增殖分化效應
　　目的:通過細胞培養(yǎng)介質(zhì)的改進探討新生小鼠睪丸組織生精細胞在體外培養(yǎng)條件下的增殖分化效應,以期提高生精細胞體外存活率,增殖率、分化率及存活時間。
　　方法:對7~8日齡小鼠生精細胞進行混合細胞培養(yǎng),采用基礎培養(yǎng)液(A組)、條件培養(yǎng)液(B組)(基礎培養(yǎng)液+20 ng/ml EGF+10 ng/ml GDNF)、分別含濃度為20％、40%、80%睪丸液(testicular

2、 abstract,TA)的基礎培養(yǎng)液(C1、C2和C3組)和分別含濃度為20%、40%、80%TA的條件培養(yǎng)液(D1、D2和D3組),通過細胞形態(tài)學觀察、存活率和粗線期精母細胞特異性基因P19、單倍體精子細胞特異性基因TP1檢測及染色體倍性分析,探討TA、GDNF和EGF對小鼠生精細胞體外培養(yǎng)增殖分化效應。
　　結(jié)果:①形態(tài)學觀察 對照組和實驗組在培養(yǎng)3~4天后均可觀察到正在分裂的細胞。B組培養(yǎng)7~8天后可觀察到細胞集落,集落間

3、可見散在圓形精子細胞,培養(yǎng)10天后,細胞集落爆發(fā)出現(xiàn),并可見變形精子細胞和帶鞭毛精子細胞,培養(yǎng)20天后,可見部分生精細胞和支持細胞凋亡。含TA(C1、C2 和 C3)組和(D1、D2和D3)組細胞生長速度介于A組和B組之間,培養(yǎng)7~8天后也可見少量細胞集落,其中正在分裂細胞偏多,圓形精子細胞少見,培養(yǎng)10天后,細胞集落增加,并可觀察到各期生精細胞,但細胞密度低于B組,培養(yǎng)15天后,細胞集落鋪滿培養(yǎng)皿底部。對實驗各組傳代培養(yǎng),A組傳代后細

4、胞生長不良,B組傳代至2~3代后細胞生長明顯減慢,且細胞暗沉發(fā)黑、貼壁性差,而C1、C2、C3組和D1、D2、D3組傳代培養(yǎng)4個月之后仍可觀察到細胞生長。②生精細胞計數(shù) 培養(yǎng)各時間階段B組生精細胞數(shù)均顯著高于其余組(P<0.05),而A組生精細胞數(shù)則顯著低于其余各組(P<0.05),其余各組間無顯著性差異;③生精細胞存活率 培養(yǎng)第5、10和15天A與B組間細胞存活率無顯著性差異,但培養(yǎng)第20天A組細胞存活率顯著低于B組(P<0.05),

5、其余組在培養(yǎng)各階段與A、B組相比細胞存活率無顯著性差異;④TP1/P19 A組在培養(yǎng)15天時TP1/P19顯著高于B組(P<0.05),B組在培養(yǎng)20天時顯著高于其余組(P<0.05),其余各培養(yǎng)組均無顯著性差異;⑤單倍體精子細胞比例 B組在培養(yǎng)第15天和20天時單倍體細胞比顯著高于其余組(P<0.05),其余各培養(yǎng)組均無顯著性差異。
　　結(jié)論:在生精細胞與支持細胞混合培養(yǎng)體系中,基礎培養(yǎng)液中添加適量GDNF和EGF可顯著提高生精

6、細胞體外培養(yǎng)的增殖分化效應,但不能延長其體外培養(yǎng)時間;基礎培養(yǎng)液中加入適量TA,可增加生精細胞體外培養(yǎng)的細胞數(shù)及時間;在含最佳濃度細胞因子培養(yǎng)液中加入適量TA,降低生精細胞體外培養(yǎng)增殖分化效應,但顯著增加生精細胞體外培養(yǎng)的時間。
　　第二部分 體外培養(yǎng)生精細胞的顯微授精研究
　　目的:對體外培養(yǎng)獲得的圓形和長形精子細胞行卵胞漿內(nèi)顯微注射術(shù)(round spermatid injection,ROSI;elongated sp

7、ermatid injection,ELSI),觀察其受精率、卵裂率、桑囊胚形成率,探討體外培養(yǎng)所獲單倍體精子細胞的受精能力以及受精后胚胎的發(fā)育潛能。
　　方法:對7~8日齡小鼠生精細胞混合細胞體外培養(yǎng)后獲得的圓形/長形精子細胞和成年小鼠睪丸內(nèi)的圓形和長形精子細胞以及成熟精子進行卵胞漿內(nèi)顯微授精,比較其受精率、卵裂率及桑囊胚形成率。
　　結(jié)果:成年小鼠睪丸內(nèi)單倍體精子細胞和體外培養(yǎng)獲得的單倍體精子細胞行ROSI/ELSI后,