尾加壓素Ⅱ(Urotensin Ⅱ)及其受體GPR14高表達(dá)與人糖尿病大動(dòng)脈病變相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　明確尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)和它的特異性受體GPR14的高表達(dá)與人糖尿病大動(dòng)脈病變的相關(guān)性，比較尾加壓素Ⅱ及其受體GPR14在糖尿病人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞與非糖尿病人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的差異性表達(dá)，探尋糖尿病大動(dòng)脈病變預(yù)防及治療的新靶點(diǎn)、新途徑。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)取臨床心外科大血管手術(shù)或冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)中收集的主動(dòng)脈組織，用組織塊貼壁法培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌原代細(xì)胞，形態(tài)學(xué)和免疫熒光法對(duì)血管

2、平滑肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，傳代后選取第3-6代細(xì)胞備用。根據(jù)病人是否有糖尿病將取自標(biāo)本培養(yǎng)的細(xì)胞分為糖尿病組和非糖尿病組，糖尿病組病人糖尿病史1年以上、平素血糖控制欠規(guī)律，術(shù)前平均血糖在11.1 mmol/L以上，非糖尿病組病人術(shù)前平均血糖在正常范圍(3.9-6.1mmol/L)。根據(jù)不同處理，糖尿病組和非糖尿病組再分別分為UⅡ組、UT拮抗組、對(duì)照組，分別給予UⅡ、UT拮抗劑、對(duì)照處理24h。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UⅡ和UT拮抗劑對(duì)糖尿病和非糖

3、尿病平滑肌細(xì)胞遷移的差異性影響;CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖程度進(jìn)行對(duì)比，明確UⅡ?qū)μ悄虿『头翘悄虿∑交〖?xì)胞促增殖作用的差別;提取各組細(xì)胞總蛋白和總mRNA分別行western blot和RT-PCR，明確糖尿病人和非糖尿病人血管平滑肌細(xì)胞中UⅡ和GPR14的差異性表達(dá)。所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用組織塊貼壁法培養(yǎng)出人主動(dòng)脈平滑肌原代細(xì)胞，傳代后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，見細(xì)胞呈梭形或長(zhǎng)

4、梭形，可重疊生長(zhǎng)，高低不平，呈典型的“峰-谷”樣，這是血管平滑肌細(xì)胞特征性生長(zhǎng)方式;免疫熒光鑒定:抗α平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白（抗α-SMA）見細(xì)胞胞漿顯示綠色熒光，且純度在90％以上。
　　2.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)
　?、匐S著時(shí)間的推移，各組OD值在一定范圍內(nèi)逐漸升高;
　?、谠谔悄虿〗M（以下簡(jiǎn)稱DM組）中，糖尿病UⅡ處理組（以下簡(jiǎn)稱UⅡ+DM組）在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性均顯著高于糖尿病UⅡ受體拮抗組（以下簡(jiǎn)稱UT+DM組

5、）(P＜0.01)和糖尿病對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱DM對(duì)照組）(P＜0.01)，UT+DM組細(xì)胞增值活性低于DM對(duì)照組(P＜0.05);
　?、墼谡＝M中，UⅡ處理組（以下簡(jiǎn)稱UⅡ+正常組）在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性均高于無(wú)糖尿病的UⅡ受體拮抗組（以下簡(jiǎn)稱UT+正常組）(P＜0.05)和正常對(duì)照組(P＜0.05)，UT+正常組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差別(P＞0.05);
　?、茉诟鲿r(shí)間點(diǎn)，經(jīng)UⅡ處理的DM組的細(xì)胞增殖活性高于UⅡ處理的正

6、常組(P＜0.05)。
　　3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
　?、僭谔悄虿〗M中，UⅡ+DM組的細(xì)胞遷移距離顯著大于UT+DM組(P＜0.01)和DM對(duì)照組(P＜0.01），UT+DM組小于DM對(duì)照組(P＜0.05);
　　②在正常組中，UⅡ+正常組的細(xì)胞平均遷移距離大于UT+正常組(P＜0.05)和正常對(duì)照組(P＜0.05），UT+正常組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差別(P＞0.05);
　?、墼谔悄虿〗M和正常組之間，UⅡ+DM組的細(xì)胞

7、遷移距離大于UⅡ+正常組(P＜0.05)。
　　4.免疫印跡(Western blot)和RT-PCR
　?、僭谔悄虿〗M內(nèi)，UⅡ+DM組中UⅡ和其受體GPR14的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量顯著高于UT+DM組(P＜0.01)和DM對(duì)照組(P＜0.01)，UT處理組UⅡ及其受體GPR14的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量低于DM對(duì)照組(P＜0.05);
　?、谡＝M內(nèi)，UⅡ和其受體GPR14的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量在UⅡ+

8、正常組中的表達(dá)量也高于UT+正常組(P＜0.05)和正常對(duì)照組(P＜0.05)，而它們?cè)赨T+正常組中的表達(dá)量與在正常對(duì)照組中的表達(dá)量并無(wú)顯著差異(P＞0.05);
　?、踀Ⅱ+DM組平滑肌細(xì)胞中UⅡ及其受體GPR14的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量高于UⅡ+正常組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.從全新的角度進(jìn)一步證實(shí)UⅡ及其受體GPR14的高表達(dá)與人平滑肌細(xì)胞增殖、遷移密切相關(guān)。
　　2.糖尿病人主動(dòng)脈平滑

9、肌細(xì)胞對(duì)UⅡ的敏感性高于非糖尿病人，更易發(fā)生遷移和增殖，從而更容易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，且糖尿病人的動(dòng)脈粥樣硬化比非糖尿病人的動(dòng)脈粥樣硬化病變程度重、范圍大。此過(guò)程是通過(guò)GPR14介導(dǎo)的第二信使通路發(fā)揮復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)所致。
　　3.除了“尾加壓素Ⅱ-GPR14”系統(tǒng)外，可能還存在其他因子通過(guò)其他通路或途徑促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而加快動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。
　　4.SB-657510作為一種磺胺類UⅡ受體拮抗