大豆種質(zhì)和培養(yǎng)條件對大豆愈傷組織積累異黃酮的影響.pdf

1、大豆異黃酮(soybean isoflavones,SI)是大豆等豆科植物生長過程中形成的一類次生代謝物。近年來研究表明,大豆異黃酮具有多種生物活性和藥理功效,是次生代謝產(chǎn)物的研究熱點之一。目前,大豆異黃酮主要從大豆粕、豆胚及加工過程的廢水中提取,提取效率較低,在自然界中資源有限,為此國內(nèi)外相繼開展了植物組織培養(yǎng)合成大豆異黃酮的工作。 本實驗與HPLC相比較,通過優(yōu)化電泳條件和采用內(nèi)標分析,改進了測定大豆異黃酮含量的高效毛細管電

2、泳方法；探討了大豆種質(zhì)異黃酮含量差異與其愈傷組織中異黃酮積累的相互關系,明確了組織培養(yǎng)過程中異黃酮的積累時期和關鍵酶PAL的動態(tài)變化,并在此基礎上探索了影響愈傷組織積累異黃酮的培養(yǎng)條件。主要實驗結果如下： 1.通過優(yōu)化電泳條件和采用內(nèi)標分析,改進了測定大豆異黃酮含量的高效毛細管電泳方法(HPCE)。最終電泳條件為：含有5％甲醇的40 mmol/L硼砂溶液(pH 10.0)為電泳緩沖液,壓力進樣20 s,柱溫25℃、分離電壓16.

3、5 kV,檢測波長為254 nm,以鷹嘴豆芽素A作為內(nèi)標物.在此條件下,6種異黃酮組分的峰面積和遷移時間的相對標準偏差(RSD)分別在0.5％～2.4％之間和1.8％～3.8％之間,加樣回收率在97.2％～103.3％之間,RSD值均小于4.0％,6種異黃酮組分可在21min內(nèi)完全分離并具有良好的線性關系。HPCE與HPLC對大豆異黃酮分離均較好,測定結果無明顯差異。HPCE是一種檢測異黃酮成分較為理想的方法。 2.不同大豆品種

4、誘導形成的愈傷組織,其生物量、異黃酮含量和產(chǎn)量的差異均達極顯著水平；大豆品種與外植體的互作對愈傷組織生物量、異黃酮含量和產(chǎn)量的影響均達極顯著水平；不同外植體誘導的愈傷組織之間,其異黃酮含量和產(chǎn)量的差異極顯著,但生物量的差異不顯著.相關分析表明,不同大豆品種(整粒、胚軸和子葉)異黃酮含量與其愈傷組織(分別由胚軸和子葉誘導)的異黃酮含量和產(chǎn)量均呈顯著正相關,由此可見大豆品種異黃酮含量與其愈傷組織的異黃酮含量和產(chǎn)量密切相關,選育異黃酮組培專用

5、型品種具有種質(zhì)遺傳基礎。實驗結果還表明,大豆品種來源、播期類型和異黃酮含量高低對其愈傷組織生長和異黃酮積累有重要影響。由建陽秋大豆胚軸誘導的愈傷組織,其生物量和異黃酮產(chǎn)量均較高,分別為1.24 g/Flask(瓶)和13.16 mg/Flask(瓶),適合作為誘導愈傷組織積累大豆異黃酮的材料。 3.由愈傷組織生長和大豆異黃酮積累的動態(tài)變化可知,愈傷組織生物量和大豆異黃酮產(chǎn)量的增長趨勢基本上一致,呈現(xiàn)"S"形曲線特征,但子葉和胚軸

6、誘導產(chǎn)生的愈傷組織間存在差異。在整個愈傷組織培養(yǎng)過程中,PAL活性呈雙峰型變化,大豆異黃酮積累之前先有一個酶活性增加過程,酶活化與最終產(chǎn)物的出現(xiàn)存在短暫的滯后時間,PAL酶活性對愈傷組織異黃酮合成存在重要影響。由此可見,在培養(yǎng)過程中愈傷組織大豆異黃酮的積累與初級代謝有密切聯(lián)系,PAL是組織培養(yǎng)合成大豆異黃酮的一個主要的限速酶。 4.培養(yǎng)條件對大豆愈傷組織生物量、異黃酮含量和產(chǎn)量的影響： (1)光照時間變化對大豆愈傷組織異

7、黃酮的合成具有顯著影響。在黑暗和光照交替處理下(8h/16h),愈傷組織的異黃酮含量最高為11.09(mg/g),同時異黃酮產(chǎn)量也最高,為12.04(mg/Flask)。結果表明,光照和黑暗處理相結合可有效促進愈傷組織生長和異黃酮的積累。 (2)蔗糖濃度變化顯著影響愈傷組織的生長和異黃酮積累,增大蔗糖濃度可以促進大豆愈傷組織中異黃酮積累,其中4％蔗糖濃度處理效果較好,異黃酮含量和產(chǎn)量分別為2％處理的1.30和1.61倍；

8、 (3)大豆愈傷組織對2,4-D、NAA和6-BA處理存在明顯的濃度效應,2,4-D濃度為1.5mg/L時效果較好,能夠?qū)崿F(xiàn)愈傷組織生物量和異黃酮含量的同步增長；6-BA濃度為0.4 mg/L時能顯著促進愈傷組織生長和異黃酮積累； (4)苯丙氨酸添加濃度對愈傷組織生長和異黃酮積累有顯著影響。濃度升高有利于愈傷組織異黃酮的積累,但對愈傷組織生物量有較大抑制作用。苯丙氨酸添加的較適濃度在0.120 mmol/L左右,在該濃度下愈傷組