體內(nèi)外研究羥基膽固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT2B1b)及其硫化產(chǎn)物對肝臟增生的影響及機制.pdf

1、前言
　　 胞漿硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT)2B1b能夠催化膽固醇及羥基膽固醇的3β-羥基硫酸化，其催化25-羥化膽固醇(25HC)硫酸化反應的主要產(chǎn)物為3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)。研究發(fā)現(xiàn)SULT281b能夠抑制羥基膽固醇對肝X受體(LXRs)的激活，并且其硫酸化產(chǎn)物可以通過抑制LXR/SREPs信號轉(zhuǎn)導通路降低細胞內(nèi)脂質(zhì)水平。而LxRs信號途徑的激活對細胞增殖起負調(diào)節(jié)作用。因此SULT2B1b及其硫化產(chǎn)物25HC

2、3S可能對肝臟增生起重要作用。本實驗中，我們在小鼠正常肝臟、原代大鼠肝臟細胞(PRH)以及小鼠肝臟部分切除術(shù)(PH)模型中研究SULT281b對肝臟增生的作用及機制，并在小鼠正常肝臟中檢測SULT281b的硫化產(chǎn)物25HC3S對肝臟增生的影響及相關(guān)機制。
　　 第一部分體內(nèi)外研究SULT2B1b對肝臟增生的影響
　　 第一節(jié) SULT2B1b對小鼠肝臟增生以及原代大鼠肝細胞(PRH)生長的影響及相關(guān)機制
　　 目

3、的：探索SULT2B1b對小鼠肝臟以及PRH增生的影響及機制。
　　 方法：將含有SULT2B1b基因的腺病毒感染C57BL/6小鼠及PRH后，運用PCNA免疫組織化學染色法檢測肝臟增生狀態(tài)；應用免疫熒光雙染法定位肝臟內(nèi)SULT281b與PCNA的表達；采用siRNA干擾技術(shù)反面驗證SULT281b對肝細胞生長的影響；通過實時定量PCR和免疫印跡的方法檢測基因表達水平。
　　 結(jié)果：體內(nèi)實驗表明小鼠肝臟組織中的PCNA陽

4、性細胞率隨SULT281b表達水平的升高而明顯增加，并存在劑量和時間依賴性；肝臟內(nèi)幾乎所有存在PCNA表達的細胞核均伴隨SULT2B1b在細胞質(zhì)的高表達，而沒有SULT2B1b表達的細胞內(nèi)也檢測不到PCNA的表達。在SULT281b相對高表達的PRH內(nèi)，采用RNA干擾技術(shù)抑制SULT281b基因的表達，引起細胞周期調(diào)節(jié)基因CDK2，F(xiàn)oxM1b，與Cyclin A的表達明顯降低。此外，LXR人工合成激動劑T0901317可有效阻斷體內(nèi)外

5、SULT281b所誘導的PCNA表達升高。
　　 結(jié)論：SULT281b能夠通過抑制LXR信號轉(zhuǎn)導通路的活性促進體內(nèi)外肝細胞增生。
　　 第二節(jié)在部分肝切除術(shù)(PH)后的小鼠模型中研究SULT2B1b對肝臟再生的影響及機制
　　 目的：研究SULT2B1b對肝臟再生的影響及機制。
　　 方法：在C57BL/6小鼠體內(nèi)建立肝臟PH再生模型，并通過尾靜脈注射含有SULT2B1b基因的腺病毒或?qū)φ詹《?；病毒感?/p>

6、5天后，應用免疫組織化學的方法分析肝再生過程中的PCNA陽性細胞率；采用HPLC技術(shù)檢測肝臟內(nèi)羥基膽固醇的變化；運用實時定量PCR和免疫印跡法檢測基因表達水平。
　　 結(jié)果：SULT281b過表達的小鼠肝臟恢復較快，約于術(shù)后三天恢復到肝臟原始大小的80％，而對照組需要將近5天達到同樣水平。SULT281b過表達增加了肝臟再生過程中的PCNA陽性細胞率以及增生相關(guān)基因的表達水平；降低了肝臟內(nèi)的羥基膽固醇含量以及LXR信號轉(zhuǎn)導通路下

7、游基因SREBP-1和ABCA1的表達水平。
　　 結(jié)論：SULT281b能夠通過抑制羥基膽固醇/LXR信號轉(zhuǎn)導通路促進肝臟損傷后的再生。
　　 第二部分在小鼠體內(nèi)研究羥基膽固醇硫化物對肝臟增生的影響及其相關(guān)機制
　　 目的：探索SULT281b的硫化產(chǎn)物(25HC3S)對小鼠體內(nèi)肝臟增生的影響及機制
　　 方法：向C57BL/6小鼠尾靜脈直接注射3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)化合物，或向感染

8、了腺病毒(Ad-SULT281b)兩天后的C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射25HC，建立高濃度外源性或內(nèi)源性25HC3S的小鼠模型；應用[3H]標記25HC3S并經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)，追蹤25HC3S在各組織器官中的分布及其藥代動力學；采用實時定量PCR，細胞周期PCR芯片以及免疫印跡法檢測相關(guān)基因的表達水平。以PCNA為增生標記，應用免疫組織化學技術(shù)分析肝臟中PCNA的陽性細胞數(shù)。
　　 結(jié)果：外源性25HC3S給藥后在小鼠體內(nèi)廣

9、泛分布于各組織器官，并在注射后48小時左右減至初始劑量的一半；25HC3S的增加上調(diào)了肝臟內(nèi)增牛相關(guān)基因Wt1，Pcna，cMyc，cyclin A，F(xiàn)oxM1b，CDC25b的表達，卻下調(diào)了細胞周期停滯基因Check2以及凋亡誘導基因Apaf1的表達；無論外源性給藥還是內(nèi)源性合成，25HC3S的應用均有效增加了PCNA陽性細胞率，降低了LXR信號轉(zhuǎn)導通路下游基因如ABCA1和SREBP-1c的表達；最后，LXR的人工合成激動劑T090