APE1單核苷酸多態(tài)性與卵巢上皮癌易感性的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:
　　卵巢上皮癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,由于在早期多無特異性癥狀且缺乏有效的診斷方法,超過70％的患者在確診時已屬中晚期,導(dǎo)致卵巢上皮癌患者死亡率極高[1,2]。雖然卵巢上皮癌的發(fā)病機(jī)理還不完全清楚,但是研究已經(jīng)表明卵巢上皮癌患者存在腫瘤抑制基因p53,人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(Phos-phatase and tensin homolog deleted on chromosome t

2、en,PTEN),乳腺癌易感基因1/乳腺癌易感基因2(Breast cancer susceptibility gene1/Breast cancer susceptibility gene 2,BRCA1/BRCA2),原癌基因人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2),鼠Kirsten肉瘤病毒致癌基因(Kirsten Rat Sarcoma Viral Onc

3、ogene,KRAS)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)等基因的改變,從而影響卵巢上皮癌的易感性[3,4]。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)雖然是最常見、最簡單的基因序列改變,但是人體表型差異、對疾病的易感性和對藥物的敏感性差異都與之相關(guān)[5]。因此,研究基因的SNP位點(diǎn),將有助于發(fā)現(xiàn)卵巢上皮癌的易感人群,并有利于卵巢上皮癌的

4、早期診斷、個體化用藥及基因的靶向治療。
　　脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(Apurinic/apyrimidini cendonuclease 1,APE1)是一種重要的多功能蛋白,不僅在堿基切除修復(fù)(Base excision repair,BER)途徑中發(fā)揮重要作用,而且可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,并參與細(xì)胞凋亡[6]。APE1不但在卵巢正常組織和卵巢上皮癌組織中存在差異性表達(dá),也在鉑類敏感和耐藥的卵巢上皮癌細(xì)胞和組織中存在差異表達(dá)[7,8

5、]。另外,許多流行病學(xué)研究表明,APE1基因的SNP位點(diǎn)與多種癌癥的易感性相關(guān)[9,10]。那么,APE1基因的SNP位點(diǎn)與卵巢上皮癌易感性是否相關(guān)及如何關(guān)聯(lián)需要進(jìn)一步研究。
　　本研究首先以卵巢上皮癌細(xì)胞株為研究對象,檢測APE1基因中SNP位點(diǎn)在各細(xì)胞株中的分布差異,篩選出有研究價值的SNP位點(diǎn)用于下一步實(shí)驗(yàn);其次,通過對84例卵巢上皮癌患者及126例健康婦女進(jìn)行臨床病例對照研究,探討在中國西北地區(qū)漢族婦女中APE1基因的SN

6、P及其聯(lián)合作用與卵巢上皮癌易感性的關(guān)系。
　　研究目的:
　　1.分析APE1基因SNPs在5種卵巢上皮癌細(xì)胞中的分布差異,并篩選出有研究意義的SNP位點(diǎn),為臨床病例對照實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　2.通過臨床病例對照研究探索APE1基因SNPs與卵巢上皮癌易感性的關(guān)系。
　　研究內(nèi)容:
　　1.結(jié)合HapMap數(shù)據(jù)庫和dpSNP數(shù)據(jù)庫,選擇進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的SNP位點(diǎn)。
　　2.以卵巢上皮癌順鉑敏感細(xì)胞株A2780

7、、SKOV3,順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/DDP、SKOV3/DDP和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HO-8910為研究對象,通過提取各細(xì)胞基因組DNA,PCR擴(kuò)增各位點(diǎn)目的產(chǎn)物,PCR產(chǎn)物直接測序檢測各位點(diǎn)在細(xì)胞株中的分布差異,序列解讀采用Chromas2軟件分析,并結(jié)合HapMap數(shù)據(jù)庫和dpSNP數(shù)據(jù)庫篩選出SNP用于下一步實(shí)驗(yàn)。
　　3.收集中國西北地區(qū)漢族人群中84例卵巢上皮癌患者及126例健康婦女的外周靜脈血,提取血液基因組DNA后應(yīng)用P

8、CR擴(kuò)增及直接測序法檢測每個研究對象APE1基因rs1760944和rs1130409位點(diǎn)的基因型。通過Chromas2軟件閱讀基因序列,并結(jié)合DNAMANV6軟件比對基因序列,對測序結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0。以Student-t檢驗(yàn)分析病例和對照組的人口學(xué)基本特征;對對照組和病例組進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn);采用非條件logistic回歸比較病例組和對照組rs1760944與rs1130409兩位點(diǎn)基

9、因型分布及等位基因分布的差異;對各位點(diǎn)基因型與卵巢上皮癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性分析,用相對風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)表示;對病例組和對照組各位點(diǎn)基因型根據(jù)年齡、初潮年齡、孕次、產(chǎn)次、絕經(jīng)狀態(tài)進(jìn)行分層分析,觀察在各亞層中各位點(diǎn)基因型與卵巢上皮癌易感性的關(guān)系;對病例組根據(jù)病理分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分層分析,以觀察在各亞層中各位點(diǎn)基因型的分布差異;為進(jìn)一步探討兩位點(diǎn)之間相互作用與卵巢上皮癌易感性的關(guān)系,對病例組和對照采用

10、PHASE2.1軟件進(jìn)行單倍體分析。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均為雙側(cè)檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.根據(jù)目前HapMap數(shù)據(jù)庫和dpSNP數(shù)據(jù)庫報(bào)道的在中國漢族人群中APE1基因各SNP位點(diǎn)的分布特點(diǎn)及其相互關(guān)系,選擇rs1760944、rs1130409、rs2307486進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。
　　2.測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)rs1760944在細(xì)胞株A2780、A2780/DDP、SKOV3和HO-8910

11、中均為GG基因型,在SKOV3/DDP中為TT基因型。rs1130409在細(xì)胞株A2780和A2780/DDP中基因型均為TG,在HO-8910、SKOV3、SKOV3/DDP中均為TT。rs2307486在各細(xì)胞株中基因型均為AA。提示:rs1760944和rs1130409兩位點(diǎn)在5株細(xì)胞中存在多態(tài)性變化,而rs2307486不存在多態(tài)性變化,因此,選擇rs1760944和rs1130409進(jìn)入臨床病例對照研究。
　　3.病例

12、組和對照組在年齡、初潮年齡、孕次、產(chǎn)次、是否絕經(jīng)方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);病例組和對照組各位點(diǎn)基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(病例組:Prs1760944=0.074,Prs1130409=0.371;對照組:Prs1760944=0.386,Prs1130409=0.241)。4.rs1130409的TG/GG基因型相對于TT基因型,等位基因G相對于T可以降低卵巢的患病風(fēng)險(xiǎn)(TG與TT相比:aOR=

13、0.468,95%CI:0.235-0.934;GG與TT相比:aOR=0.229,95%CI:0.105-0.500;G與T相比:aOR=0.678,95%CI:0.348-0.741)。但是,本研究沒有發(fā)現(xiàn)rs1760944多態(tài)性與卵巢上皮癌易感性相關(guān)。
　　5.在分層研究中發(fā)現(xiàn),在年齡≥50歲(aOR=0.756,95%CI:0.611-0.935),初潮年齡≥15歲(aOR=0.672,95%CI:0.514-0.880)

14、,孕次≥3次(aOR=0.629,95%CI:0.466-0.848),產(chǎn)次≥3次(aOR=0.655,95%CI:0.464-0.925和已絕經(jīng)婦女(aOR=0.769,95%CI:0.618-0.957)中,rs1130409的TG/GG基因型相對于TT基因型對卵巢上皮癌的保護(hù)作用更加明顯,但是各基因型在臨床分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分層分析中不存在分布差異。rs1760944多態(tài)性在病例組和對照組人口學(xué)基本特征變量的分層研究中未發(fā)現(xiàn)

15、與卵巢上皮癌易感性相關(guān);在對病例組臨床基本特征變量進(jìn)行的分層分析中也未發(fā)現(xiàn)各基因型存在分布差異。
　　6.在單倍體研究中發(fā)現(xiàn)4種單倍體存在分布差異;并且與T-T單倍體相比,T-G和G-G單倍體都會降低卵巢上皮癌的患病風(fēng)險(xiǎn),而G-T單倍體未發(fā)現(xiàn)與卵巢上皮癌患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。
　　研究結(jié)論:
　　1.APE1基因rs1130409位點(diǎn)的多態(tài)性可能與卵巢上皮癌易感性相關(guān),但是本研究未發(fā)現(xiàn)rs1760944位點(diǎn)的多態(tài)性與卵巢上皮癌

16、易感性相關(guān)。
　　2.rs1130409位點(diǎn)TG/GG基因型和G等位基因分別相對于TT基因型和T等位基因可以降低卵巢上皮癌的患病風(fēng)險(xiǎn);這種保護(hù)作用在年齡≥50歲,初潮年齡≥15歲、孕次≥3次、產(chǎn)次≥3次和已絕經(jīng)婦女更加明顯。rs1130409各基因型在臨床分期和是否有淋巴轉(zhuǎn)移各亞層中不存在分布差異。
　　3.rs1760944多態(tài)性在年齡、初潮年齡、孕次、產(chǎn)次、是否絕經(jīng)各亞層的分析中沒有發(fā)現(xiàn)與卵巢上皮癌易感性相關(guān);各基因型在