基于鈣循環(huán)異變的CVB-D對缺血性心衰的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 觀察環(huán)維黃楊星D(CVB-D)對缺血性心衰大鼠心功能的保護(hù)作用，明確其對急性分離大鼠心肌細(xì)胞和乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的影響，揭示藥物對LTCC、RYR2、SERCA2a、NCX鈣循環(huán)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，為CVB-D臨床用于缺血性心衰的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)部分。
　　 1．利用冠脈結(jié)扎法復(fù)制心衰大鼠模型，通過超聲心動圖篩選心衰模型大鼠(EF

2、≤45％)，對大鼠進(jìn)行分組給藥，連續(xù)給藥30天后，觀察CVB-D對心衰大鼠一般狀態(tài)、存活率、M型超聲心動圖參數(shù)、頻譜多普勒超聲心動圖參數(shù)、血流動力學(xué)、左心室微循環(huán)、血漿內(nèi)ANP、AngⅡ和ET含量、心臟質(zhì)量(HM)、左心室質(zhì)量(LVM)、心臟質(zhì)量指數(shù)(HMI)、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)、心肌組織學(xué)檢查和評分、Masson染色檢查心肌組織間質(zhì)膠原及間質(zhì)膠原體積分?jǐn)?shù)(ICVF)、心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、心肌組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-

3、Mg2+-ATP酶活性等指標(biāo)進(jìn)行檢查，擬明確藥物對模型大鼠的保護(hù)作用，并獲取量效關(guān)系。
　　 2．同上部分進(jìn)行缺血性心衰大鼠模型復(fù)制、分組及給藥，給藥30天后對缺血性心衰大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行急性分離，利用激光共聚焦顯微技術(shù)觀察電刺激下心肌細(xì)胞的鈣瞬變幅度、鈣瞬變峰值到達(dá)時(shí)間以及衰減時(shí)間（達(dá)峰至衰減50%所經(jīng)歷的時(shí)間），以觀察藥物對衰竭心肌細(xì)胞鈣瞬變的影響。
　　 3．原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，利用激光共聚焦顯微技術(shù)觀察心肌細(xì)胞鈣

4、離子濃度變化，以鈣瞬變峰值、鈣瞬變達(dá)峰時(shí)間、達(dá)峰速度、鈣瞬變衰減時(shí)間和衰減速度為檢測指標(biāo)來反應(yīng)心肌細(xì)胞鈣釋放和鈣攝取能力。細(xì)胞分4組，每組在觀察心肌細(xì)胞自發(fā)活動鈣瞬變后分別加入地爾硫卓(10umol/L)、釕紅(10umol/L)、氯化鎳(5mol/L)、咖啡因(10mol/L)后，觀察鈣瞬變情況后均再加入CVB-D(10-5mol/L)后，再次觀察心肌細(xì)胞的鈣瞬變各指標(biāo)的改變，以此評價(jià)藥物對鈣循環(huán)相關(guān)蛋白功能的影響。
　　 4

5、．采用冠脈結(jié)扎法復(fù)制缺血性心衰大鼠模型，將造模大鼠分為模型組、卡托普利組、CVB1.0mg/kg組和CVB2.0mg/kg組，每組8只。另加假手術(shù)組大鼠8只，共計(jì)5組。給藥30天后取心臟，通過免疫熒光組織化學(xué)法、westernblot和RT-PCR法觀察LTCC、RYR2、SERCA2a、NCX四種鈣循環(huán)通道蛋白功能和相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平，擬從鈣循環(huán)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化上進(jìn)一步闡明藥物對缺血性心衰的保護(hù)作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：

6、r>　　 1．與假手術(shù)組比較，模型組存活率、LVPWd、IVS、EF、LVFS、CO、SV、CI、A峰、LVSP、±dp/dtmax、左室微循環(huán)、心肌組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均可見顯著減少(P＜0.05，0.01)，而LVIDs、LVESV、HR、E峰、E/A、HR、LVEDP、t-dp/dtmax、射血時(shí)間、血漿ANP、AngⅡ和ET含量、LVM、HM、LVMI、HMI的顯著增加(P＜0.05，0

7、.01)。心肌HE染色結(jié)果表明模型組心肌細(xì)胞肥大，肌纖維排列紊亂，粗細(xì)不等，局部斷裂。間質(zhì)小血管增生，血管壁增厚，周圍纖維組織增生，組織損傷程度評分顯著增加(P＜0.05，0.01)。Masson三色法染色中，假手術(shù)組左心室基本無纖維化組織，而模型組大鼠左心室中大量心肌細(xì)胞壞死、消失形成大量膠原纖維，ICVF顯著增加(P＜0.05，0.01)。模型組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有嚴(yán)重?fù)p傷，心肌細(xì)胞核固縮，核膜邊界發(fā)生斷裂，輪廓不清。肌原纖維排列紊亂

8、、斷裂及缺失，相鄰肌纖維間閏盤間隙明顯增寬。線粒體可見散布于細(xì)胞外，嵴紊亂、部分?jǐn)嗔?，可見空泡化。以上結(jié)果提示缺血性心衰模型已形成。CVB-D三個(gè)劑量組(0.5、1.0和2.0mg/kg)可見LVIDs、LVESV、HR、E/A、LVM、HM、LVMI、HMI、血漿ANP水平的顯著降低，CO、CI、SV、EF、LVFS、心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的顯著增加（與模型組比較P＜0.05，0.01）。而中、高劑量組還可降低E峰，

9、減少血漿AngⅡ和ET含量，升高Na+-K+-ATP酶活性（與模型組比較P＜0.05，0.01）。而高劑量組還可見A峰、SAP、LVSP、±dp/dtmax、左室微循環(huán)的增加，同時(shí)減少HR、LVEDP、t-dp/dtmax，縮短射血時(shí)間（與模型組比較P＜0.05，0.01）。HE檢查表明CVB-D低、中、高劑量組可見肌纖維排列較有序、整齊，心肌細(xì)胞輕度肥大，間質(zhì)少量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維組織輕度增生，染色相對均勻，顯著降低病理評分（與模型

10、組比較P＜0.05，0.01）。Masson染色中CVB-D低、中、高劑量組可見心肌細(xì)胞數(shù)目明顯增多，排列規(guī)則有序，膠原纖維明顯減少，ICVF也見顯著降低（與模型組比較P＜0.05，0.01）。電鏡檢查發(fā)現(xiàn)CVB-D低、中、高劑量組，可見心肌細(xì)胞肌原纖維接近正常，排列較緊密，細(xì)胞核接近正常，核膜邊界有明顯改善，線粒體體積變小，空泡狀態(tài)明顯減少，無纖維紊亂、斷裂及缺失，較接近正常組。
　　 2．利用激光共聚焦觀察急性分離心肌細(xì)胞[

11、Ca2+]i實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CVB（0.5，1.0，2.0mg/kg）可顯著增加鈣瞬變幅度，縮短鈣瞬變達(dá)峰時(shí)間和衰減時(shí)間（與模型組比較P＜0.05，0.01）。
　　 3．在乳鼠心肌細(xì)胞[Ca2+]i檢測中，釕紅阻斷乳鼠心肌細(xì)胞RYR2通道后，可見鈣瞬變幅度和達(dá)峰速度顯著降低，衰減時(shí)間的顯著縮短（與自發(fā)狀態(tài)比，P＜0.05，0.01）。給予CVB-D后，并未見鈣瞬變各指標(biāo)的顯著改變（與釕紅處理相比，P＞0.05）。地爾硫卓注射液阻斷乳

12、鼠心肌細(xì)胞LTCC后，可見鈣瞬變幅度顯著降低，同時(shí)衰減時(shí)間顯著縮短(與自發(fā)狀態(tài)比，P＜0.01)。給予CVB-D后，可見鈣瞬變幅度和達(dá)峰速度的顯著增加（與釕紅處理相比，P＜0.01）。NiC12阻斷乳鼠心肌細(xì)胞NCX后，可見鈣瞬變衰減時(shí)間顯著延長和衰減速度的減慢（與自發(fā)狀態(tài)比，P＜0.05，0.01）。給予CVB-D后，可見鈣瞬變幅度、達(dá)峰速度和衰減速度的顯著增加（與釕紅處理相比，P＜0.01），衰減時(shí)間有進(jìn)一步延長的趨勢?？Х纫虼偈谷?/p>

13、鼠心肌細(xì)胞SERCA2a失活后，可見鈣瞬變幅度，鈣瞬變速度、衰減速度的顯著增加，達(dá)峰時(shí)間和衰減時(shí)間的顯著延長（與自發(fā)狀態(tài)比，P＜0.05，0.01）。給予CVB-D后，衰減時(shí)間可見進(jìn)一步延長（與釕紅處理相比，P＜0.05）。
　　 4．心衰模型組大鼠RYR2、SERCA2a蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于假手術(shù)組大鼠，而NCX的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平卻顯著高于假手術(shù)組大鼠(P＜0.05，0.01)，CVB-D1.0，2.0mg/kg

14、顯著抑制了心衰所致的RYR2、SERCA2a蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的減少，同時(shí)也抑制了NCX蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的增加(P＜0.05，0.01)。而各組大鼠LTCC表達(dá)未見顯著改變。
　　 結(jié)論：
　　 對于缺血性心衰，CVB-D通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)LICC、RYR2、SERCA2a、NCX四種鈣循環(huán)通路蛋白中后三種蛋白的功能，保證心肌細(xì)胞收縮時(shí)有足夠數(shù)量的鈣離子釋放，舒張時(shí)又能通過促進(jìn)鈣回?cái)z迅速降低胞內(nèi)鈣離子濃