microRNA-27a在肝癌中的初步探討.pdf

1、原發(fā)性肝癌，是世界第五大常見腫瘤，死亡率高居第三，在中國(guó)則高居第二。盡管肝癌的治療手段包括化學(xué)治療、放射治療、肝臟規(guī)則性切除、肝移植及局部治療等已有了很大的進(jìn)展，但肝癌病人的預(yù)后還是很差，即使根治術(shù)后5年生存率僅17％-53％，而且復(fù)發(fā)率很高。造成肝癌預(yù)后差的原因主要有兩個(gè):其一是常規(guī)的化療對(duì)肝癌幾乎無(wú)效;其二是現(xiàn)有的早期診斷指標(biāo)存在不足，超過(guò)80％的患者就診時(shí)已處于進(jìn)展期而失去最佳的手術(shù)切除機(jī)會(huì)。肝癌特異性的更早期的標(biāo)記物可以發(fā)現(xiàn)更早

2、期的病人，就會(huì)有時(shí)間提供更早的干預(yù)治療，改善病人的預(yù)后。盡管目前對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)步，但是還沒(méi)有找到解決肝癌患者更早期診斷得有效辦法，以改善預(yù)后。因此研究肝癌病例中異常表達(dá)的特異性分子標(biāo)記物，將有助于肝癌的早期發(fā)現(xiàn)病人和改善預(yù)后。
　　MicroRNAs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類重要的基因調(diào)節(jié)分子，成熟的miRNAs是一類約19～25nt單鏈非編碼RNA分子，可通過(guò)完全或不完全特異性堿基配對(duì)與靶基因mRNA分子

3、3'UTR端相結(jié)合，通過(guò)促進(jìn)靶基因mRNA的降解、調(diào)控靶基因的翻譯以及抑制靶基因的翻譯，參與細(xì)胞一系列的重要過(guò)程，包括細(xì)胞分化、增殖與凋亡，從而在生理與疾病過(guò)程中起著重要作用。越來(lái)越多的研究表明miRNAs在腫瘤組織與癌旁組織的表達(dá)具有明顯差異。miRNAs表達(dá)譜可將肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病與鄰近正常組織區(qū)分開。更重要的是發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上的miRNAs定位于與腫瘤發(fā)生相關(guān)的染色體區(qū)域和脆性位點(diǎn)，提示miRNAs在腫瘤形成過(guò)程中可能

4、扮演著重要的角色。但是其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究還處于初級(jí)階段，因此研究與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的miRNAs表達(dá)的變化，探索肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，能夠?yàn)楦伟┑脑缙谠\斷和預(yù)后預(yù)測(cè)以及篩選治療靶點(diǎn)提供有價(jià)值的依據(jù)。
　　本課題初步探討microRNA-27a（以下簡(jiǎn)寫miR-27）在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。本研究共分兩部分:第一部分，我們通過(guò)TaqMan探針檢測(cè)了臨床肝癌標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本中miR-27a的表達(dá)情況;第二部分我們通

5、過(guò)生物信息學(xué)分析，研究和探討了miR-27a與其靶蛋白R(shí)YBP(RING1 and YY1 binding protein)之間的相互作用，并研究其在HCC發(fā)生發(fā)展中可能的作用機(jī)制。
　　第一部分肝癌組織與癌旁組織中miR-27a的表達(dá)情況的檢測(cè)
　　[目的]目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNAs在許多腫瘤中失調(diào)表達(dá)，miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。已有的研究亦表明miR-23a～27a～24在肝癌組織以及與癌旁組織表達(dá)中存在差異。本研究

6、擬進(jìn)一步在肝癌患者中驗(yàn)證miR-27a的表達(dá)以及其單獨(dú)作為肝癌分子標(biāo)記物的可能性。
　　[方法]應(yīng)用TaqMan(@) MGB探針?lè)ǘ繖z測(cè)miR-27a在94例HBV陽(yáng)性癌和癌周組織以及6例血管瘤旁組織中的表達(dá)，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析其在癌和癌周組織中的表達(dá)差異。同時(shí)也檢測(cè)了10種肝細(xì)胞株中miR-27a
　　[結(jié)果] miR-27a在肝癌組織與癌周組織的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05，paired-samples t te

7、st)。利用TaqMan(@) MGB探針?lè)z測(cè)miR-27a在10種肝細(xì)胞系(9種腫瘤細(xì)胞系和一種永生化的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(LO2))中的表達(dá)情況。結(jié)果證實(shí):miR-27a在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中處于高表達(dá)，顯著高于LO2，但是在高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中沒(méi)有顯著差異。
　　[結(jié)論]肝癌組織與癌旁組織之間存在miRNA差異表達(dá)， miR-27a或許可以成為一個(gè)肝癌相關(guān)的生物標(biāo)記物。
　　第二部分miR-27a生物學(xué)功能探討
　　[目的]

8、已有的研究表明miR-27a在肝癌癌組織與癌旁組織的差異表達(dá)，而相應(yīng)關(guān)于RYBP的研究表明其與miR-27a表達(dá)是負(fù)相關(guān)，前期的研究表明miR-27a可能調(diào)控RYBP。本部分主要研究miR-27a與RYBP的相互作用以及其在肝癌中的作用。
　　[方法]通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pre-miR-27a，建立miR-27a過(guò)表達(dá)和干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并研究miR-27a與RYBP之間的相互作用，利用熒光素酶報(bào)告基因研究miR-27a與RYBP之間的直

9、接作用。Real-time與Western blot進(jìn)一步觀察了miR-27a在調(diào)節(jié)RYBP過(guò)程中的重要作用。
　　結(jié)果:采用TargetScan5.1和Pictar網(wǎng)站預(yù)測(cè)到RYBP為miR-27a的靶基因。熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-27a在肝癌細(xì)胞株中發(fā)生不同程度的上調(diào)，伴隨著RYBP表達(dá)量的下調(diào)，RYBP是一個(gè)Polycomb group(PcG)相關(guān)蛋白，在肝腫瘤細(xì)胞中miR-27a的表達(dá)與RYBP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。我

10、們?cè)贖epG2、MHCC-97H以及MHCC-LM3細(xì)胞株中對(duì)miR-27a和RYBP的關(guān)系進(jìn)行了更深入的研究。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pre-miR-27a到這三種細(xì)胞中以后，上調(diào)的miR-27a可以抑制RYBP mRNA和蛋白的表達(dá);而轉(zhuǎn)染miR-27a的抑制序列到這兩種細(xì)胞中以后，結(jié)果顯示抑制miR-27a的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)RYBP mRNA和蛋白的表達(dá)水平。這說(shuō)明miR-27a可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)RYBP的表達(dá)。然后將RYBP基因的3'UTR克隆到

11、雙熒光素報(bào)告基因載體psi-check2的多克隆位點(diǎn)，觀察miR-27a的效應(yīng)，結(jié)果表明其miR-27a可以直接作用于RYBP基因的3' UTR起調(diào)控作用。
　　構(gòu)建miR-27a慢病毒表達(dá)載體，感染細(xì)胞，顯著提高細(xì)胞內(nèi)miR-27a表達(dá)水平，同時(shí)抑制RYBP mRNA和蛋白的表達(dá)，并增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力;與之相反的是，抑制細(xì)胞內(nèi)miR-27a表達(dá)，則促進(jìn)RYBP mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制了細(xì)胞的增殖能力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)

12、miR-27a對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-27a過(guò)表達(dá)的細(xì)胞，G0/G1期的細(xì)胞減少，S期的細(xì)胞增多。
　　[結(jié)論]以上結(jié)果證實(shí)miR-27a通過(guò)下調(diào)RYBP基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制RYBP介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制以及改變細(xì)胞周期。miR-27a可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些結(jié)果說(shuō)明在肝癌中異常表達(dá)的miR-27a通過(guò)抑制RYBP，進(jìn)而改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為如細(xì)胞增殖、抗凋亡能力。綜上說(shuō)明miR-27a在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮原癌基因的