鈣敏感受體通過胱硫醚-γ-裂解酶調控內源性H2S抑制巨噬細胞泡沫化的機制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎，其主要表現(xiàn)為大動脈及中動脈的血管內壁出現(xiàn)脂質沉積，形成分散的或成片的粥樣斑塊，造成動脈管腔狹窄，隨后斑塊破裂出血，可以在狹窄的動脈內形成血栓，導致缺血性腦卒中、心肌梗死的發(fā)生。引起AS的原因很復雜，除高血壓外，脂質代謝紊亂，炎癥反應以及自身免疫也是重要因素。所以，預防AS的發(fā)生并防止其發(fā)展，對防治心腦血管疾病有重要意義。
　　硫化氫(H2S)是新發(fā)現(xiàn)的一種內源性氣體信號分子。內源性

2、H2S是機體多種細胞內半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和半胱氨酸轉移酶催化作用下產(chǎn)生的。其中CSE能大量地表達于血管平滑肌細胞(VSMC-s)、動脈內皮細胞(ECs)和單核源性巨噬細胞并產(chǎn)生H2S，是心血管系統(tǒng)H2S的主要來源，而CSE催化產(chǎn)生的內源性H2S不但在擴張血管、促進凋亡和抑制增殖等方面起作用，還在AS的形成過程中起到重要作用。
　　鈣敏感受體(CaR)是G蛋白偶聯(lián)受體家族中C家族的成

3、員。已有研究報道CaR在巨噬細胞中不僅存在表達，而且能夠通過G蛋白-PLC-IP3通路引起細胞內Ca2+含量的增加，細胞內Ca2+含量的增加又可以通過Ca2+/CaM通路增強鈣調蛋白(CaM)的活性，從而抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉化。還有研究報道高表達的CaM可以通過提高CSE的活性，促進H2S的生成來抑制泡沫細胞的形成。但CaR是否能夠通過促進巨噬細胞內CSE的表達和H2S的分泌來抑制泡沫細胞的形成尚不得而知。 PI3K/Akt信號通

4、路是維持細胞生存、增殖最重要的信號傳導通路之一，可以直接影響AS的發(fā)生發(fā)展。研究證實CaR可以通過影響PI3K/AKT信號通路的傳導來抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉化，但CaR調控PI3-K/AKT信號通路傳導的具體機制尚不清楚。因此，本文以巨噬細胞作為研究對象，利用ox-LDL誘導泡沫細胞形成，探討高表達的CaR是否能夠通過增強CSE的表達及促進H2S的分泌來抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉化，同時研究CaR調控CSE的表達是否與CaM有關。<

5、br>　　材料與方法：
　　一、實驗材料
　　細胞株
　　THP-1人單核巨噬細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，該細胞株屬人類單核細胞系。
　　二、主要研究方法
　　1、細胞培養(yǎng)及建立泡沫細胞模型
　　2、敏感硫電極法檢測巨噬細胞中H2S含量的變化。
　　3、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)測定巨噬細胞內游離鈣的變化。
　　4、HPLC測定細胞內膽固醇含量及油

6、紅O染色檢測陽性細胞的相對含量。
　　5、ELISA法檢測細胞因子IL-10、MIF和TNF-a的分泌情況。
　　6、RT-PCR、Q-PCR法檢測各組細胞中CaR和CSE的表達。
　　7、Western blot法檢測各組細胞中CaR、CSE、PI3K、p-AKT、CD36和AC-AT-1的表達。
　　8、統(tǒng)計學處理:所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，所得結果用均數(shù)±SD表示，采用ANOVA分析。P

7、＜0.05認為有顯著性差異并在統(tǒng)計學上有意義。
　　結果：
　　1、敏感硫電極法檢測H2S的相對含量結果顯示:與空白對照組比較，CaR激動劑GdCl3(10ug/ml)組和NaHS(70ug/ml)組作用泡沫細24、48和72h后，H2S的相對含量明顯增加（P＜0.05），但當其作用超過48h以后這種促進H2S分泌的作用不再明顯增強;而CaR抑制劑NPS2390(50ug/ml)組作用泡沫細胞24、48和72h后，細胞H2S

8、的相對含量明顯降低（P＜0.05），但當其作用超過48h以后這種抑制H2S分泌的作用不再明顯增強。與空白對照組比較，GdCl3組作用泡沫細胞48后H2S的相對含量明顯增加（P＜0.05）;而GdCl3+CSEsiRNA組和CSEsiRNA組H2S的相對含量明顯降低（P＜0.05）。
　　2、油紅O染色檢測和HPLC檢測結果顯示:與空白對照組比較，GdCl3和NaHS組作用泡沫細胞24、48和72h后，巨噬細胞泡沫化程度均明顯降低（

9、P＜0.05），但當其作用超過48h以后這種抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉化的作用不再明顯增強;而NPS2390組作用泡沫細胞24、48和72h后，巨噬細胞泡沫化程度明顯增加（P＜0.05），但當其作用超過48h以后這種促進巨噬細胞向泡沫細胞轉化的作用不再明顯增強。
　　3、ELISA法檢測作用24、48和72h后的各組細胞上清中IL-10、TNF-a和MIF的分泌情況:結果顯示，與空白對照組比較，GdCl3和NaHS組細胞上清中TNF

10、-a和MIF含量均明顯降低，而IL-10的含量明顯增多(P＜0.05);NPS2390組細胞培養(yǎng)的上清中TNF-a和MIF的含量均明顯增加，而IL-10的含量明顯降低（P＜0.05）。
　　4、RT-PCR、Q-PCR、Western blot法檢測CaR和CSE的表達情況:結果顯示，與空白對照組比較，GdCl3組CaR和CSE的表達均明顯增加，而CD36和A-CAT-1的表達被明顯抑制(P＜0.05);NPS2390組CaR和C

11、SE的表達均明顯被抑制，而CD36和ACAT-1的表達被明顯增強（P＜0.05）;NaHS組CaR和CSE的表達無明顯變化，而CD36和ACAT-1的表達被明顯抑制（P＜0.05）。
　　5、RT-PCR、Q-PCR和Western blot檢測CSE、PI3K和p-AKT的表達情況:結果顯示，與空白對照組比較，GdCl3組明顯增強CSE的表達，而PI3K和p-AKT的表達被明顯抑制;CaM抑制劑(U73122)組和GdCl3+C

12、aM抑制劑(U73122)組PI3K和p-AKT的表達被明顯增強，而CSE的表達被明顯降低(P＜0.05)。
　　6、LSCM檢測作用48h后的各組細胞Ca2+熒光強度變化，結果顯示:與空白對照組比較，GdCl3組、U73122組和GdCl3+U73122組細胞質內Ca2+熒光強度均明顯增加（P＜0.05）。
　　7、敏感硫電極法檢測H2S的相對含量結果顯示:與空白對照組比較，GdCl3組作用泡沫細胞48后H2S的相對含量明

13、顯增加（P＜0.05）;而U73122組和GdCl3+U73122組H2S的相對含量明顯降低（P＜0.05）。
　　8、油紅O染色檢測和HPLC檢測結果顯示:與空白對照組比較，GdCl3組作用泡沫細胞48h后，巨噬細胞泡沫化程度明顯降低（P＜0.05），而U73122組和GdCl3+U73122組巨噬細胞泡沫化程度均明顯增加(P＜0.05)。
　　結論：
　　1、證實CaR可以增強CSE的表達，促進內源性H2S的分泌，