綿羊Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的克隆及其對(duì)綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化的作用.pdf

1、Notch1基因突變能夠造成果蠅的殘翅，因此而得名。Notch信號(hào)通路是調(diào)節(jié)胚胎期和出生后衛(wèi)星細(xì)胞激活與增殖的一個(gè)重要的信號(hào)通路，能夠影響骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的特異性及其細(xì)胞命運(yùn)決定，通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡從而影響肌肉生長。目前，尚未見到綿羊Notch基因的有關(guān)報(bào)道，尚不清楚Notch基因?qū)d羊肌衛(wèi)星細(xì)胞的功能和作用，因此，克隆綿羊Notch基因，明確其對(duì)綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞的作用，對(duì)進(jìn)一步研究綿羊骨骼肌的發(fā)育機(jī)制具有重要意義。
　　

2、本研究利用RT-PCR方法克隆了綿羊Notch1胞內(nèi)段NICD基因，將其與慢病毒表達(dá)載體pLEX-mcs連接，構(gòu)建了pLEX-NICD真核表達(dá)載體。利用Preplate法分離了綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞，并采用免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞純度，通過慢病毒感染建立了pLEX-NICD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞系，采用細(xì)胞生長曲線測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)以及免疫熒光技術(shù)分析了在過表達(dá)情況下NICD對(duì)綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的作用。進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測(cè)

3、了Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化，從細(xì)胞水平探討了NICD對(duì)綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化的作用機(jī)制。本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、克隆了2388 bp綿羊Notch胞內(nèi)段序列，并提交至Genbank(登錄號(hào):KF318190.1)。在綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞中過表達(dá)NICD，Western blotting檢測(cè)顯示，NICD在綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞中獲得表達(dá)。
　　2、利用Preplate差速貼壁法從胎羊肌肉組織中分離培養(yǎng)了肌衛(wèi)星細(xì)胞

4、，利用Pax7、Desmin和MyoD免疫熒光鑒定分離培養(yǎng)的衛(wèi)星細(xì)胞純度，同時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)確定了純度達(dá)94％。
　　3、細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)NICD基因的肌衛(wèi)星細(xì)胞相較對(duì)照細(xì)胞生長速度顯著減慢（從第二天開始培養(yǎng)至第六天差異極顯著(P＜0.01)）。細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)NICD的肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)入S期的時(shí)間比對(duì)照細(xì)胞晚，且在S期細(xì)胞數(shù)目比對(duì)照細(xì)胞數(shù)目減少了6.32％。該結(jié)果與生長曲線結(jié)果相符。表明，NICD對(duì)綿羊肌衛(wèi)

5、星細(xì)胞增殖具有抑制作用。
　　4、免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞MyHC蛋白表達(dá)，計(jì)算肌管融合率，結(jié)果顯示，NICD過表達(dá)細(xì)胞系肌管融合率為1.4％，顯著低于對(duì)照組細(xì)胞系的6.63％。
　　5、定量結(jié)果顯示，增殖狀態(tài)下，Notch上調(diào)p21基因的表達(dá)，提示Notch通過正調(diào)控p21基因的表達(dá)抑制綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖;分化狀態(tài)下，Notch下調(diào)MyoD基因的表達(dá)，提示Notch通過負(fù)調(diào)控MyoD基因的表達(dá)抑制綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞分化。研究結(jié)果表明N