免疫低下人群中侵襲性真菌和HCMV更昔洛韋耐藥株.pdf

1、目的：近年來(lái)，隨著免疫低下人群，尤其是移植群體的不斷增多，侵襲性真菌病（invisive fungal disease，IFD）和巨細(xì)胞病毒病的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。其中侵襲性真菌感染的高發(fā)病率與高死亡率已經(jīng)引起了人們的高度關(guān)注，早期有效的抗真菌治療可以明顯改善疾病預(yù)后，而當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的常規(guī)檢測(cè)方法由于其敏感性和耗時(shí)性等缺陷，難以滿足臨床的需求，亟需尋求一種更加靈敏和特異的IFD 檢測(cè)方法,因此需要建立一種IFD 檢測(cè)用通用PCR 法，

2、為目前臨床真菌感染的早期診斷、預(yù)防和治療提供有效工具。此外，HCMV(人巨細(xì)胞病毒)的潛伏激活感染也是威脅移植患者生命安全的重要因素之一，隨著更昔洛韋的普遍使用，HCMV 對(duì)該藥耐受日趨嚴(yán)重，已經(jīng)成為影響移植患者壽命的一個(gè)重要因素，因此建立一種方法檢測(cè)HCMV 更昔洛韋耐藥株是非常必要的。
　　 方法：參考文獻(xiàn)報(bào)道的多種真菌基因組DNA 提取方法，經(jīng)過(guò)改良后，用于相關(guān)標(biāo)本中真菌基因組的提取，并根據(jù)真菌核糖體DNA(rDNA)序列

3、，設(shè)計(jì)通用PCR 擴(kuò)增引物，以本實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離菌株作痰標(biāo)本的檢測(cè)中, 分別對(duì)97 份痰標(biāo)本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和培養(yǎng)鑒定，結(jié)果為PCR 陽(yáng)性89 例，陰性8 例；科瑪嘉平板培養(yǎng)7 天后，73 例有真菌生長(zhǎng)，24 例無(wú)真菌生長(zhǎng)，對(duì)所有培養(yǎng)產(chǎn)物再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果73 例真菌菌株P(guān)CR 擴(kuò)增71 例為陽(yáng)性，2 例為陰性；而24 例陰性培養(yǎng)產(chǎn)物中有14 例PCR 擴(kuò)增為陽(yáng)性，10 例為陰性；把PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，并在

4、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1例為青霉樣曲霉感染，其它均為白假絲酵母菌感染。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明三種方法的真菌檢測(cè)敏感性順序?yàn)樘抵苯覲CR 法＞痰培養(yǎng)后PCR 法＞痰培養(yǎng)法；另一方面,在痰標(biāo)本的檢測(cè)應(yīng)用中,將其用于采集自46 位患者的118份血漿標(biāo)本的檢測(cè)。
　　 結(jié)果顯示：跟蹤隨訪的46 位患者中有白假絲酵母菌感染患者4 例，煙曲霉感染患者2 例，分支孢子菌屬感

5、染患者1 例，肉座菌目/支頂孢屬感染患者4 例，肉座菌目感染患者1 例，未知樹(shù)粉孢屬/未知真菌感染患者1 例，未知真菌感染患者18 例，雜菌或其它感染患者1 例，陰性病人11 例，產(chǎn)物測(cè)序分析失敗患者3 例。ROC 曲線進(jìn)行分析，將IFD 臨床擬診患者和IFD 臨床診斷患者歸類為陽(yáng)性時(shí)，ROC 曲線下的面積為0.888，用OD 值判斷IFD 的診斷情況具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000＜0.05），OD 值越高，患者被診斷為IFD 的可能性

6、越大，面積的95％可信區(qū)間為（0.787，0.990），不包括0.5，也得出相同的結(jié)論，當(dāng)以O(shè)D=47作為IFD 的臨界值時(shí)，診斷效果最佳，其對(duì)應(yīng)的敏感性和特異性分別為0.938 和0.786；將IFD 臨床擬診患者歸類為陰性時(shí)，ROC 曲線下的面積為0.85，面積的95％可信區(qū)間為（0.74，0.961），當(dāng)以O(shè)D=271.5 作為IFD 的臨界值時(shí)診斷效果最佳，其對(duì)應(yīng)的敏感性和特異性分別為0.818和0.75。IFD 臨床診斷和擬診

7、患者共計(jì)32 例，利用卡方檢驗(yàn)（SPSS16.0）對(duì)各種檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示P=0.000＜0.05，表明各種檢測(cè)方法的結(jié)果在95％置信水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各種檢測(cè)方法的敏感性和特異性也存在差異，其中PCR 法的敏感性和特異性俱佳，當(dāng)5種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，檢測(cè)靈敏性高達(dá)96.88％（31/32）。HCMV 耐藥的檢測(cè)方面，HCMV DNA 經(jīng)巢式PCR 擴(kuò)增，其產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示7 個(gè)條帶的相對(duì)分子量符合目的基因的大小

8、，測(cè)序結(jié)果使用DNAstar 分析，與病毒基因文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)一致。
　　 結(jié)論：通過(guò)對(duì)當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室內(nèi)真菌破壁方法進(jìn)行了改進(jìn)，使其破壁更加高效，提高了真菌基因組DNA 的得率，且適合在一般實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作；在前人工作的基礎(chǔ)上，建立了IFD 通用PCR 檢測(cè)法，并初步探討了其靈敏性、特異性和穩(wěn)定性，為后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)；當(dāng)前國(guó)內(nèi)真菌感染的分子檢測(cè)仍停留在培養(yǎng)后真菌菌落的檢測(cè)，本課題組在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)了真菌基因組DNA 的提取方法，

9、使其適合于臨床標(biāo)本的檢測(cè)；臨床應(yīng)用的結(jié)果表明：將電泳圖片用軟件處理后，可得到定量結(jié)果，以電泳圖片上靶條帶OD 值表示，OD 值越大，患者出現(xiàn)IFD 的可能性越高，無(wú)論將擬診病人歸類為陽(yáng)性還是陰性，均能找到相應(yīng)的OD 臨界值，并且較高的靈敏性和特異性，建議：當(dāng)OD＜47 時(shí)，為患者IFD 陰性；47≤OD≤271.5 為患者IFD 臨床擬診；OD>271.5 為患者IFD 臨床診斷。
　　 通過(guò)對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，可以將病