TNFα、C3a、C5a上調D407細胞系VEGF表達轉錄途徑的初步研究.pdf

1、目的：初步確定TNF α、C3a、C5a上調D407 VEGF表達的時相、劑量反應關系，進一步探討NF-k B轉錄因子跟VEGF表達上調的關系。 方法： 第一部分：分別用1500U/ml TNF α、100ng/ml C3a、100ng/mlC5a刺激D407細胞，每種刺激物分別刺激8hrs、16hrs、24hrs后，收取細胞上清和細胞，用ELISA法測定細胞上清VEGF濃度，用RT-PCR法測定細胞VEGF mRNA相

2、對水平。每個時間點均設立對照組。 第二部分：實驗分為無預處理組和PDTC預處理組(預處理組在加入刺激物之前用100μM PDTC預處理30min)。在每組里，分別用不同濃度的TNF α(1500、3000 U/ml)、C3a(100、300、500ng/ml)、C5a(100、300、500ng/ml)刺激細胞24hrs后，收取細胞上清，用ELISA法測細胞上清VEGF濃度。每組均設置對照組。 第三部分：分別用不同濃度的

3、TNF α(1500、3000 //ml)、C3a(100、300、500ng/ml)、C5a(100、300、500ng/ml)刺激細胞30min，用免疫熒光法檢測細胞內P65的分布；用PDTC預處理后，分別用1500、3000 U/mlTNF α刺激細胞30min，用免疫熒光法檢測P65。基礎狀態(tài)下免疫熒光為對照。 結果： 第一部分：ELISA：用TNF α、C3a、C5a刺激8hrs時，C3a組比對照組高(19.6

4、％)，而TNF α、C5a組較對照組低(分別低16.6％和24.5％)；刺激16hrs時，TNFα、C3a組明顯高于對照組(分別高56.4％和47.4％)，C5a組比對照組略高(3.6％)；24hrs時，TNFα、C3a、C5a比對照組增高的幅度進一步增大(分別為83.7％、57.9％、8.4％)。RT-PCR：刺激8hrs時，C3a組VEGF mRNA的表達較對照組高，TNF α組較對照組低，C5a組跟對照組差別不大；16hrs時，T

5、NF α、C3a組明顯比對照組高，C5a組比對照組略高；24hrs時，對照組和TNF α組不能檢測到表達，但C3a組仍有較強的表達，C5a組有低水平表達。 第二部分：不同濃度TNF α、C3a、C5a刺激D407細胞24hrs后，各實驗組細胞上清VEGF濃度均比對照組高：其中，TNF α組比對照組高43.1％-57.4％，1500U/ml濃度時增加較明顯；C3a組比對照組高17.3％-32.1％，300ng/ml濃度時增加最明顯

6、；C5a組比對照組高14.7％-31.8％，300ng/ml濃度最明顯；PDTC預處理可以部分抑制TNFQ和C5a對VEGF分泌水平的上調，但對于C3a組，PDTC預處理反而進一步增加了VEGF的分泌水平。 第三部分：1500U/ml、3000 U/ml TNFQ刺激30 min后，NF-K B P65發(fā)生核轉移，100 μ M PDTC預處理30min可以抑制其核轉移；不同濃度C3a(100、300、500ng/ml)、C5a