電針預(yù)處理通過CB1R上調(diào)TGF-β1發(fā)揮腦保護作用的研究.pdf

1、“隨著社會人口結(jié)構(gòu)老齡化問題日益嚴重,我國中風(fēng)發(fā)生率以每年8.7％的速度增長,其中缺血性卒中占80%。我國腦卒中發(fā)病率居世界第一,腦卒中已成為我國第一位死因和成年人首要的致殘病因,嚴重影響生活質(zhì)量,給患者及其家庭和社會帶來極大的精神及經(jīng)濟負擔(dān)[1,2,3,4]。經(jīng)典的溶栓劑治療,即重組組織型纖溶酶元激活物(rtPA),因其治療時間窗短(中風(fēng)發(fā)生后3-4.5h),增加治療期間顱內(nèi)出血風(fēng)險,在臨床應(yīng)用受限,僅有約5%的中風(fēng)患者可以得到及時有

2、效的溶栓治療;另外對復(fù)發(fā)型及合并心血管疾病的中風(fēng)患者抗血小板治療需嚴格的適應(yīng)癥征和精確的用藥劑量防止更為嚴重的并發(fā)癥。因此,中風(fēng)的治療需要更加科學(xué)的策略,為中風(fēng)患者和家庭尋找更加有效的防治措施將成為今后研究的重點和熱點方向?！?br>　　“隨著對中風(fēng)病理機制的研究進一步深入,現(xiàn)在認識到:興奮性毒性、梗死周圍去極化、神經(jīng)炎癥和程序性細胞死亡各種導(dǎo)致缺血損傷的機制,由缺血引發(fā),在不同時相相互重疊緊密聯(lián)系。這種缺血級聯(lián)反應(yīng)在腦缺血發(fā)生后幾分鐘

3、內(nèi)引起不可逆的神經(jīng)元損傷,中樞系統(tǒng)神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與了由血液供應(yīng)中斷而引發(fā)的急性腦血管事件的各個病理生理階段,不但導(dǎo)致腦缺血損傷并且參與了隨后的神經(jīng)組織修復(fù)的進程。由此可見,神經(jīng)炎癥是腦卒中導(dǎo)致缺血再灌注損傷及神經(jīng)恢復(fù)的重要因素,研究腦缺血損傷的炎癥機制將是神經(jīng)保護研究的熱點和重點。我們實驗室之前的研究證實電針預(yù)處理可上調(diào)腦缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元α7nAChR表達,顯著降低腦再灌注損傷后腦組織和血漿中促炎因子HMGB1水平,抑制神經(jīng)系

4、統(tǒng)炎癥產(chǎn)生腦保護作用,然而電針在神經(jīng)系統(tǒng)中的抗炎作用機制相關(guān)研究遠未揭示,有待進一步闡明。另外我們證實電針在缺血前和缺血發(fā)生后通過大麻素系統(tǒng)上調(diào)腦缺血周圍組織 CB1R受體激活內(nèi)源性保護機制而發(fā)揮腦保護作用,而最新的體外實驗研究證實大麻素參與了神經(jīng)炎癥反應(yīng),有明顯的抗炎作用。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)對炎癥反應(yīng)的作用機制是目前的研究熱點,然而其機制并不完全清楚,其與炎癥介質(zhì)和炎癥因子的交互作用是復(fù)雜而多向的?！?br>　　“轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF

5、-β)是具有多種功能的細胞因子,其在抑制神經(jīng)炎癥中的作用已被認可,TGF-β在中樞神經(jīng)及某些外周器官的發(fā)育和形成過程中扮演重要角色,具有神經(jīng)保護作用。TGF-β可影響腦缺血后活化的小膠質(zhì)細胞的功能狀態(tài)發(fā)揮腦保護作用,各種腦損傷或疾病均可誘導(dǎo)TGF-β表達,并表現(xiàn)出其神經(jīng)保護作用。在中樞內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與TGF-β交互作用于小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生一定的保護作用。由此,本研究一方面著眼于TGF-β可能是電針腦保護機制的重要組成部分,另一方面明確內(nèi)源

6、性大麻素系統(tǒng)與TGF-β的關(guān)系,為臨床治療中風(fēng)提供更加充分的理論依據(jù)及新的手段和靶點?！?br>　　實驗一:電針預(yù)處理對腦缺血后TGF-β1表達的影響
　　目的:觀察電針預(yù)處理對缺血再灌注后大鼠腦組織半暗帶TGF-β1表達變化的影響。
　　方法:
　　1.電針的腦保護作用
　　見以往的電針腦保護研究。
　　2.在腦缺血再灌注損傷后半暗區(qū)TGF-β1的表達變化及電針對TGF-β1表達影響雄性SD大鼠根據(jù)缺血再

7、灌注損傷后時間點不同隨機分為8組(n=6):假手術(shù)組(Sham)、再灌注后2h、4h、6h、12h、24h、48h及72h,在各時間點將動物處死取腦并切取半暗帶,提取組織蛋白,Western Blot檢測不同時間點TGF-β1的表達情況。
　　雄性SD大鼠分組同I,再灌注24h后處死動物(n=6),運用western blot觀察該時間點各組TGF-β1的表達情況
　　3.電針刺激對半暗區(qū)神經(jīng)元TGF-β1表達量的影響

8、>　　雄性SD大鼠隨機分為3組(n=4),拔除線栓再灌注24h,將動物處死,多聚甲醛灌流固定腦組織,冰凍組織切片后進行免疫熒光染色。同時將TGF-β1與神經(jīng)元的標(biāo)記物NeuN進行免疫熒光雙標(biāo)染色。
　　結(jié)果:
　　Western blot結(jié)果顯示,再灌注損傷發(fā)生后6h,缺血再灌注組TGF-β1表達量較Sham組顯著上調(diào)(P<0.05),其中以24小時表達量較高。缺血再灌后24小時,與I/R組相比,EA組半暗帶組織中的TGF-

9、β1含量明顯增高(P<0.05)。使用TGF-β1和神經(jīng)元的標(biāo)記物 NeuN雙標(biāo)記,其結(jié)果顯示電針預(yù)處理腦缺血再灌注損傷后24h TGF-β1表達在神經(jīng)元細胞上明顯增多。
　　結(jié)論:
　　缺血再灌注后腦缺血周圍組織TGF-β1表達增高,電針預(yù)處理可進一步上調(diào)其表達發(fā)揮腦保護作用,電針預(yù)處理可在缺血后24小時上調(diào)神經(jīng)元TGF-β1表達。
　　實驗二:TGF-β1在電針腦保護中的作用研究
　　目的:觀察下調(diào)TGF-β

10、1表達對電針保護作用的影響及外源性 TGF-β1的對腦缺血再灌注損傷的影響
　　方法:
　　雄性SD大鼠,隨機分為6組(n=8):Sham組、I/R組、EA組和EA+TGF-β1干擾RNA組、EA+MAB240(TGF-β1中和抗體)組、I/R+重組TGF-β1。缺血前48h側(cè)腦室注射TGF-β1干擾RNA(25nmol);缺血前0.5h,側(cè)腦室注射MAB240(TGF-β1中和抗體)(0.4 mg/kg),重組TGF-β1

11、(0.8 ug/Kg),容量均為10ul。動物經(jīng)歷2h缺血后于再灌注72h處死,進行神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死容積測定。
　　結(jié)果:
　　再灌注72h,EA組腦梗死容積較I/R組顯著降低(P<0.05),并且神經(jīng)行為學(xué)評分較I/R組有所改善(P<0.05)。EA+siRNA和EA+MAB240與EA組相比梗死面積顯著增加(P<0.05),而I/R+重組TGF-β1組與I/R組相比腦梗死容積明顯減少(P<0.05),產(chǎn)生了與電針預(yù)

12、處理相似的作用。與EA組相比,EA+siRNA組和EA+MB240行為學(xué)評分明顯降低(P<0.05),與I/R組相比外源性給予重組TGF-β1可顯著改善大鼠腦缺血再灌注后72小時的神經(jīng)行為學(xué)評分(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　下調(diào)TGF-β1的表達可以逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護作用,而外源性TGF-β1可模擬電針的腦缺血耐受作用
　　實驗三:TGF-β1在電針預(yù)處理抗凋亡中的作用研究
　　目的:進一步觀察TGF-

13、β1對電針預(yù)處理腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
　　方法:
　　1.TGF-β1對神經(jīng)細胞凋亡的影響
　　雄性SD大鼠,用隨機數(shù)字法隨機分為5組(n=4):Sham組、I/R組、EA組、EA+TGFβ-siRNA組及I/R+重組TGF-β1組。缺血前48h,進行TGF-β1-siRNA(25nmol)側(cè)腦室注射,缺血前0.5h重組TGF-β1(0.8 ug/Kg)側(cè)腦室注射,容量均為10ul。動

14、物經(jīng)歷2h缺血后于再灌注后24h處死,灌流后制作石蠟切片,進行TUNEL染色,觀察各組切片神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量的變化。
　　2.TGF-β1對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
　　雄性SD大鼠隨機分為分5組(n=6):Sham組、I/R組、EA組、EA+siRNA組和I/R+rhTGF-β1組。于再灌注24h處死取缺血半暗帶,通過western blot對Bcl-2和Bax進行蛋白定量分析,觀察對凋亡相關(guān)蛋白表達量的影響。
　　結(jié)果

15、:
　　EA組中 TUNEL陽性細胞的數(shù)量較I/R組(P<0.01)顯著減少,EA+siRNA組較EA組顯著增多(P<0.01)。I/R組Bax/Bcl-2的比率較Sham組升高(P<0.05)。EA組Bax/Bcl-2的比率較I/R組則顯著下調(diào)(P<0.05)。電針預(yù)處理組給予TGF-β1-siRNA側(cè)腦室注射則可以顯著下調(diào) Bcl-2的表達并上調(diào) Bax的表達而增加兩者的比值(P<0.05)。而I/R組予以側(cè)腦室注射重組TGF

16、-β1可顯著降低兩者比值(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　下調(diào)TGF-β1能夠增加大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞的凋亡,拮抗電針預(yù)處理的腦保護作用,而重組的TGF-β1減輕缺血后神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,產(chǎn)生擬電針樣腦保護作用,說明TGF-β1通過對抗凋亡,在電針腦保護作用中發(fā)揮了重要的作用。
　　實驗四電針通過大麻素CB1調(diào)控TGF-β1表達的研究
　　目的觀察電針預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷后大麻素對TGF-β1的表達的

17、影響
　　方法
　　1.CB1受體拮抗劑對電針預(yù)處理后TGF-β1表達的影響
　　雄性SD大鼠,隨機分為4組(n=6):I/R組、EA+I/R組、EA+AM251(SR141716A)組和EA+DMSO組。電針預(yù)處理2h后制作腦缺血模型,制作模型前0.5h腹膜內(nèi)注射AM251(SR141716A),劑量為1mg/kg(1.5mg/kg),于再灌注損傷后24h處死取皮層半暗帶,Western Blot測定半暗帶TGF-β

18、1表達含量。
　　2.CB1受體的干擾RNA對電針預(yù)處理后TGF-β1表達的影響
　　雄性SD大鼠,分組同前:I/R組、EA+I/R組、EA+CB1R-siRNA組和EA+Vehicle組。電針預(yù)處理2h后制作腦缺血模型,制作模型前48h側(cè)腦室內(nèi)注射CB1R-siRNA(10μg/10μl),于再灌注損傷后24h處死取皮層半暗帶,Western Blot測定半暗帶TGF-β1表達含量。
　　3.CB1受體激動劑ACEA

19、對電針預(yù)處理后TGF-β1表達的影響
　　雄性SD大鼠,隨機分為3組(n=6):I/R組、I/R+ACEA組和I/R+Vehicle組。制作模型前0.5h腹膜內(nèi)注射ACEA,劑量為2.5 mg/kg,于再灌注損傷后24h處死取皮層半暗帶,Western Blot測定半暗帶TGF-β1表達含量。
　　結(jié)果
　　再灌注后24h測得 EA+AM251組半暗帶 TGF-β1的相對表達含量較 EA組和EA+DMSO組顯著降低(P

20、<0.05);EA+SR141716A組半暗帶TGF-β1的相對表達含量較EA組和EA+DMSO組顯著降低(P<0.05);EA+CB1-siRNA組TGF-β1表達量較EA組EA+Vehicle組顯著降低(P<0.05);I/R+ACEA組TGF-β1表達相對含量較I/R組和I/R+vehicle組顯著上調(diào)(P<0.05)。
　　結(jié)論
　　電針預(yù)處理的同時給予CB1受體的拮抗劑AM251、SR141716A和CB1受體的干

21、擾RNA,抑制CB1受體的生物活性,發(fā)現(xiàn)兩類藥物能夠逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理后TGF-β1表達的上調(diào);與之相反現(xiàn)象的是,實驗中給予CB1受體的受體激動劑ACEA,則能夠模擬電針預(yù)處理后TGF-β1表達的上調(diào),提示電針預(yù)處理可通過上游CB1受體調(diào)節(jié)TGF-β1的表達發(fā)揮腦保護作用。
　　小結(jié)
　　1.電針預(yù)處理可以改善腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死容積,增加缺血半暗帶TGF-β1的表達。
　　2.抑制TGF-β1分子可以