基于調(diào)節(jié)P-AKT1、FⅧR-Ag的腦脈通對(duì)老齡大鼠腦缺血-再灌注損傷腦微血管生成機(jī)制研究.pdf

1、背景:缺血性腦血管?。↖CVD）作為臨床常見的危急重病之一，其高致殘率及高死亡率已嚴(yán)重威脅人類健康。目前，大量的研究集中于挽救和改善神經(jīng)元存活和功能恢復(fù)，而有關(guān)腦缺血后腦微血管再生、微循環(huán)重建等方面，較少引起關(guān)注。在腦缺血早期，通過血管生成以建立新的血管網(wǎng)，恢復(fù)缺血區(qū)的血供，將能挽救瀕死的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。血管新生可通過多種蛋白因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，而PI3K/AKT作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，常作為改善腦血管病患者預(yù)后

2、的一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)。腦缺血后自身“代償性血管再生”為缺血性腦血管病的病理機(jī)制研究提供了新的思路，但由于這種自然代償過程緩慢，且產(chǎn)生的側(cè)枝循環(huán)常灌注不足，不能挽救瀕死的神經(jīng)元而導(dǎo)致神經(jīng)功能的損害，因此，選取有效的藥物或其他干預(yù)手段促進(jìn)缺血后血管生成顯得尤為重要。近年來，關(guān)于中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病的研究較多，且已獲得一定的療效，雖然其作用機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，但促進(jìn)血管再生可能是其重要作用機(jī)制之一。而本課題前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，中藥復(fù)方腦脈通對(duì)缺血再

3、灌注損傷有顯著的保護(hù)作用，促進(jìn)缺血區(qū)血管新生是其保護(hù)腦損傷的重要途徑。因此，本課題在以前研究的基礎(chǔ)上，從p-Akt1及FⅧR:Ag表達(dá)變化方面探討老齡大鼠腦缺血/再灌注腦微血管生成機(jī)制，并以此為切入點(diǎn)進(jìn)一步闡釋中藥復(fù)方腦脈通對(duì)微血管生成的促進(jìn)作用及其可能的作用機(jī)制。
　　目的:
　　1.以SD大鼠為研究對(duì)象，采用線栓法制備局灶性大腦中動(dòng)脈腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停^察腦缺血再灌注損傷后青年和老齡大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24

4、h、3d、6d、12d行為學(xué)改變及腦血管超微結(jié)構(gòu)變化；研究腦脈通對(duì)老齡大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　2.采用免疫組織化學(xué)方法檢測青年和老齡大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d腦微血管p-Akt1表達(dá)變化；研究腦脈通對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注損傷p-Akt1表達(dá)變化的影響。
　　3.采用免疫組織化學(xué)方法檢測青年和老齡大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d腦微血管FⅧR:A

5、g表達(dá)變化；研究腦脈通對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注損傷FⅧR:Ag表達(dá)變化的影響。
　　方法:
　　1.采用MCAO線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血3h，再灌注24h、3d、6d、12d動(dòng)物模型，觀察腦缺血3h，再灌注1d、3d、6d、12d神經(jīng)功能評(píng)分、并通過電鏡觀察各組大鼠在腦I/R后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織超微結(jié)構(gòu)變化，以進(jìn)一步探討腦脈通對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織病理改變的影響。
　　2.采用MCAO線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺

6、血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d動(dòng)物模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法比較各組大鼠在腦缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后腦組織p-Akt1的表達(dá)變化，觀察腦脈通對(duì)老齡大鼠缺血再灌注后p-Akt1表達(dá)變化的影響。
　　3.采用MCAO線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d動(dòng)物模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法比較各組大鼠在腦缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后腦組織FⅧ:Ag的

7、表達(dá)變化，觀察腦脈通對(duì)老齡大鼠缺血再灌注后FⅧ:Ag表達(dá)變化的影響。
　　結(jié)果:
　　1.老齡大鼠腦缺血/再灌注（I/R）后神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織超微結(jié)構(gòu)變化及腦脈通對(duì)其表達(dá)的影響
　　1.1各組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能綜合評(píng)分：青年模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均低于青年假手術(shù)組。青年模型組I/R1d、3d、6d、12d組神經(jīng)功能評(píng)分均低于青年模型組I3h；青年模型組I/R3d、6d神經(jīng)功能評(píng)分低于青年模型組I/R1d，青

8、年模型組I/R12d神經(jīng)功能評(píng)分高于青年模型組I/R1d；青年模型組I/R6d神經(jīng)功能評(píng)分低于青年模型組I/R3d，青年模型組 I/R12d神經(jīng)功能評(píng)分高于青年模型組 I/R3d；青年模型組I/R12d神經(jīng)功能評(píng)分高于青年模型組I/R6d。老齡模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均低于老齡假手術(shù)組。老齡模型組I/R1d、3d、6d、12d組神經(jīng)功能評(píng)分均低于老齡模型組I3h；老齡模型組I/R3d、6d神經(jīng)功能評(píng)分低于老齡模型組I/R1d，老齡

9、模型組I/R12d神經(jīng)功能評(píng)分高于老齡模型組I/R1d；老齡模型組I/R6d神經(jīng)功能評(píng)分低于老齡模型組I/R3d，老齡模型組 I/R12d神經(jīng)功能評(píng)分高于老齡模型組 I/R3d；老齡模型組I/R12d神經(jīng)功能評(píng)分高于老齡模型組I/R6d。與老齡模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組及尼莫地平組神經(jīng)功能障礙評(píng)分均增高。腦脈通組I/R1d、3d、6d、12d組神經(jīng)功能評(píng)分均低于腦脈通組I3h；腦脈通組I/R3d、6d神經(jīng)功能評(píng)分低于腦脈通組I/R1

10、d，腦脈通組I/R12d組神經(jīng)功能評(píng)分高于腦脈通組I/R1d；腦脈通組I/R6d組神經(jīng)功能評(píng)分低于腦脈通組 I/R3d，腦脈通組 I/R12d組神經(jīng)功能評(píng)分高于腦脈通組I/R3d；腦脈通組I/R12d神經(jīng)功能評(píng)分高于腦脈通組I/R6d。與尼莫地平組相同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組I/R1d、I/R3d、I/R6d神經(jīng)功能障礙評(píng)分均增加。
　　1.2各組大鼠腦缺血后腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化:青年假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)微血管結(jié)構(gòu)完整，基膜及管周均無水

11、腫。血管基底膜連續(xù)完整，無溶解、斷裂、卷曲、脫落、缺失等。內(nèi)皮細(xì)胞胞漿正常，無水腫。線粒體結(jié)構(gòu)清淅，無腫脹、斷裂。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常。青年模型組可見管周圍輕度水腫（I3h、I/R6d、 I/R12d，照片2、5、6）、中重度水腫（I/R1d、 I/R3d，照片3、4）。內(nèi)皮細(xì)胞線粒體可輕度水腫（I3h、I/R6d、I/R12d，照片2、5、6）?；啄げ糠峙で?，基底膜部分水腫（I/R1d、I/R3d，照片3、4），血管基底膜溶解、斷裂、

12、缺損（I/R1d、I/R3d、I/R6d，照片3-5）。老齡假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)微血管結(jié)構(gòu)完整，基膜及管周無明顯水腫，血管基底膜連續(xù)完整，無溶解、斷裂、卷曲、脫落、缺失等（照片7）。老齡模型組可見管周圍輕度水腫（I/R6d、I/R12d，照片11、12）、中重度水腫（I3h、I/R1d、I/R3d，尤以I/R3d最重，照片8-10）。內(nèi)皮細(xì)胞線粒體水腫（I3h、I/R1d、I/R6d，照片8、9、11）。血管基底膜溶解、斷裂、缺損（I3h

13、、I/R1d、I/R3d、I/R6d，照片8-11）。腦脈通組可見管周圍輕度水腫（I/R6d，照片16），內(nèi)皮細(xì)胞線粒體水腫（I3h、I/R1d、I/R6d，照片13、14、16）。尼莫地平組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體水腫（I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d，尤以I/R12d最重，照片18-22）。
　　2.老齡大鼠腦缺血/再灌注損傷 p-Akt1表達(dá)變化及腦脈通對(duì)其表達(dá)的影響
　　青年模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠p-Akt

14、1表達(dá)水平強(qiáng)于青年假手術(shù)組。青年模型組I/R1d、6d表達(dá)強(qiáng)于青年模型組I3h，青年模型組I/R3d、12d表達(dá)弱于青年模型組I3h；青年模型組I/R6d表達(dá)強(qiáng)于青年模型組I/R1d，青年模型組I/R3d、12d表達(dá)弱于青年模型組I/R1d；青年模型組I/R6d表達(dá)強(qiáng)于青年模型組I/R3d；青年模型組I/R12d表達(dá)弱于青年模型組I/R6d。與青年模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡模型組p-Akt1表達(dá)均減弱。老齡模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠p-Akt1

15、表達(dá)水平強(qiáng)于老齡假手術(shù)組。老齡模型組I/R1d、6d表達(dá)強(qiáng)于老齡模型組I3h，老齡模型組I/R12d表達(dá)弱于老齡模型組I3h；老齡模型組I/R6d表達(dá)強(qiáng)于老齡模型組I/R1d，老齡模型組I/R3d、12d表達(dá)弱于老齡模型組I/R1d；老齡模型組I/R6d表達(dá)強(qiáng)于老齡模型組I/R3d，老齡模型組I/R12d表達(dá)弱于老齡模型組I/R3d；老齡模型組I/R12d表達(dá)弱于老齡模型組I/R6d。與老齡模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組及尼莫地平組p-

16、Akt1表達(dá)水平增強(qiáng)。腦脈通組I/R1d、3d、6d、12d表達(dá)均強(qiáng)于腦脈通組I3h；腦脈通組I/R6d表達(dá)強(qiáng)于腦脈通組I/R1d，腦脈通組I/R3d、12d表達(dá)弱于腦脈通組I/R1d；腦脈通組I/R6d、12d表達(dá)強(qiáng)于腦脈通組I/R3d；腦脈通組I/R12d表達(dá)弱于腦脈通組I/R6d。
　　3.老齡大鼠腦缺血/再灌注損傷FⅧR:Ag表達(dá)變化及腦脈通對(duì)其表達(dá)的影響
　　青年模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠FⅧR:Ag表達(dá)水平均強(qiáng)于青年假手

17、術(shù)組。青年模型組I/R3d、6d表達(dá)均強(qiáng)于青年模型組I3h，青年模型組I/R1d表達(dá)弱于青年模型組I3h；青年模型組I/R3d、6d、12d表達(dá)均強(qiáng)于青年模型組I/R1d；青年模型組I/R6d表達(dá)強(qiáng)于青年模型組I/R3d;青年模型組I/R12d表達(dá)弱于青年模型組I/R3d；青年模型組I/R12d表達(dá)弱于青年模型組I/R6d。與青年模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡模型組FⅧR:Ag表達(dá)水平降低。老齡模型組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均較老齡假手術(shù)組增強(qiáng)。老齡模

18、型組I/R3d、6d大鼠表達(dá)強(qiáng)于老齡模型組I3h，老齡模型組I/R1d表達(dá)弱于老齡模型組I3h；老齡模型組I/R3d、6d、12d表達(dá)強(qiáng)于老齡模型組I/R1d；老齡模型組I/R6d表達(dá)強(qiáng)于老齡模型組I/R3d，老齡模型組I/R12d表達(dá)弱于老齡模型組I/R3d；老齡模型組I/R12d表達(dá)弱于老齡模型組I/R6d。腦脈通組及尼莫地平組各時(shí)間點(diǎn)大鼠FⅧR:Ag表達(dá)水平均強(qiáng)于老齡模型組。腦脈通組I/R3d、6d、12d表達(dá)均強(qiáng)于腦脈通組I3h

19、，腦脈通組I/R1d表達(dá)弱于腦脈通組I3h；腦脈通組I/R3d、6d、12d表達(dá)強(qiáng)于腦脈通組I/R1d；腦脈通組I/R6d表達(dá)強(qiáng)于腦脈通組I/R3d；腦脈通組I/R12表達(dá)弱于腦脈通組I/R3d。
　　結(jié)論:
　　1.通過對(duì)腦缺血/再灌注損傷后老齡大鼠神經(jīng)功能癥狀及腦組織超微結(jié)構(gòu)變化的觀察，與青年模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，老齡模型組大鼠腦I/R后組織損傷出現(xiàn)較早，損傷程度較重，且恢復(fù)較慢。而隨著大鼠缺血再灌注時(shí)間的延長，各組大鼠