飼料中添加硫胺素對(duì)建鯉魚肉、魚糜品質(zhì)及肌肉Cystatin-Cathepsins表達(dá)的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)主要研究飼料中添加硫胺素(VB1)對(duì)幼建鯉肌纖維特性、魚肉品質(zhì)及魚糜凍藏品質(zhì)的影響。在此基礎(chǔ)上，初步探討具有抗氧化特性的硫胺素通過調(diào)節(jié)Cystatin/Cathepsins表達(dá)影響魚肉品質(zhì)形成的可能作用途徑，以及其影響魚糜凍藏品質(zhì)的可能作用機(jī)制。
　　1、硫胺素水平對(duì)建鯉肌纖維特性、魚肉品質(zhì)的影響
　　實(shí)驗(yàn)選擇300尾健康建鯉幼魚（初重8.20±0.02g），平均分為兩組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾。缺乏組和正常組分

2、別飼喂硫胺素水平為0.25mg/kg、1.06mg/kg的半純合飼料。60天后測定魚肉品質(zhì)，結(jié)果表明:飼喂正常水平硫胺素的建鯉幼魚與缺乏組相比，其新肌纖維募集能力強(qiáng)，肌纖維密度、肌原纖維耐折力及剪切力都極顯著提高(p＜0.01)，肌纖維平均直徑、pH和失水率降低，肉質(zhì)明顯提高。
　　2、硫胺素水平對(duì)建鯉魚糜凍藏品質(zhì)的影響
　　取兩組建鯉背肌，制成魚糜進(jìn)行凍藏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:
　　1)漂洗后的魚糜（凍藏0周），正常組CT

3、S B和CTS L活性極顯著低于缺乏組(p＜0.01);正常組魚糜肌動(dòng)球蛋白Ca2+-ATPase活性和總巰基含量極顯著(p＜0.01)高于缺乏組，表面疏水性極顯著(p＜0.01)低于缺乏組，二硫鍵、TBA值顯著（0.01＜p＜0.05）低于缺乏組。
　　2)凍藏期間，正常組肌動(dòng)球蛋白Ca2+-ATPase活性和總巰基含量始終極顯著(p＜0.01)高于缺乏組，表面疏水性及二硫鍵始終極顯著(p＜0.01)或顯著（0.01＜p＜0.0

4、5）低于缺乏組。而TBA值在凍藏1、2周時(shí)正常組與缺乏組差異不顯著(p＞0.05)，但凍藏4、6周時(shí)，正常組分別顯著(0.01＜p＜0.05）、極顯著(p＜0.01)地低于缺乏組。
　　3)凍藏6周后，兩組魚糜制備成魚糜凝膠。缺乏組魚糜凝膠破斷力和凝膠強(qiáng)度均極顯著(p＜0.01)低于正常組。且相對(duì)于正常組，掃描電鏡下缺乏組凝膠結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)多且大的空洞。
　　3、CTS B、CTS L的基因克隆與誘導(dǎo)表達(dá)及抗體制備
　

5、　提取鯉魚卵總RNA，通過RT-PCR得到cDNA，再經(jīng)PCR擴(kuò)增CTS B、CTS L成熟肽鏈片段，大小分別為755、665bp。而后構(gòu)建CTS B/L-pMD19-T重組克隆表達(dá)載體并進(jìn)行測序，經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切及連接反應(yīng)，構(gòu)建原核表達(dá)載體CTSB/L-pET-30a，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)菌落PCR檢測、雙酶切和單酶切鑒定正確后，將該原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliBL21(DE3)。CTS B和CTS

6、L均分別在1mmol/L的IPTG，37℃，3h及0.5mmol/L的IPTG，37℃，2h的最適誘導(dǎo)條件下，成功表達(dá)了包涵體形式的蛋白。通過菌體的超聲破碎，離心分離得到CTS B、CTS L蛋白，再經(jīng)尿素梯度洗滌及鎳親和層析純化得到蛋白CTS B、CTS L。用純化蛋白免疫Balb/C小鼠制備抗體，CTS B、CTS L抗體效價(jià)分別達(dá)到1∶256000、1∶512000。
　　4.硫胺素水平對(duì)建鯉Cystatin、 CTS B、

7、CTS L表達(dá)和活性的影響
　　通過real-time PCR及免疫組化技術(shù)，檢測正常組和缺乏組建鯉背肌中Cystatin、CTS B、CTS L在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量，并測定Cystatins（超家族）的抑制活性及CTS B、CTS L酶活性。結(jié)果表明:mRNA水平上，正常組Cystatin、CTS L mRNA表達(dá)量低于缺乏組，差異不顯著(p＞0.05)，而CTS BmRNA表達(dá)量顯著（0.01＜p＜0.05）低于缺

8、乏組。蛋白水平上，正常組Cystatin、CTS B蛋白含量均極顯著（p＜0.01）低于缺乏組，CTS L蛋白含量顯著（0.01＜p＜0.05）低于缺乏組。正常組背肌中Cystatins（超家族）的抑制活性顯著（0.01＜p＜0.05）低于缺乏組，CTS B、CTS L活性極顯著(p＜0.01)低于缺乏組。這表明飼料中添加的硫胺素水平與建鯉肌肉組織中Cystatin、CTS B、CTS L的表達(dá)量及Cystatins、 CTS B、CT