姜黃素激活Nrf2-ARE通路保護(hù)丙烯腈對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性的研究.pdf

1、研究背景和目的：活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一組含有化學(xué)性質(zhì)活潑的含氧功能基團(tuán)的化合物，是生物體內(nèi)的主要自由基。它具有強(qiáng)烈引發(fā)脂質(zhì)過氧化的作用，幾乎可與任何細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，引起鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞的凋亡、壞死和功能失調(diào)。正常情況下機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。而當(dāng)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體抗氧化能力下降，組織細(xì)胞ROS增多，組織脂質(zhì)過氧化水平升高，引起DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)表達(dá)異

2、常，從而對(duì)機(jī)體造成損害。它在老年癡呆癥、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病及化學(xué)中毒性神經(jīng)損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，扮演著重要角色。
　　 丙烯腈(Acrylonitril，AN)是有機(jī)合成工業(yè)的重要原料，廣泛應(yīng)用于合成腈綸纖維、丁腈橡膠、工程塑料、合成樹脂等。近年來由于相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及AN制品不斷走進(jìn)生活，職業(yè)和生活接觸機(jī)會(huì)明顯增多，為保護(hù)接觸人群健康，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其毒性特別是神經(jīng)毒性進(jìn)行了積極探索。但AN對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)毒作用以及確切機(jī)理迄今尚

3、不清楚。已有研究表明，AN降低機(jī)體抗氧化能力，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，因而從氧化-抗氧化角度深入探討AN神經(jīng)毒性的機(jī)理以及尋求有效的化學(xué)防護(hù)劑已成為AN毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　 姜黃素(Curcumin，CUR)是從姜科植物姜黃(Cuma Longa L.)根莖中提取出來的一種酚類色素成分，由于其色澤穩(wěn)定且毒性很低，目前已廣泛應(yīng)用于食品添加劑和染料中。眾多研究結(jié)果提示，CUR具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基等多方面藥理

4、作用。對(duì)肝臟、腎臟和免疫系統(tǒng)等多方面都顯示了較好的保護(hù)作用。但到目前為止，有關(guān)CUR神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道還不是很多。
　　 近年來，核轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor NuclearFactor-Erythroid-2-related factor2，Nrf2)在調(diào)控氧化應(yīng)激中所起的作用受到越來越多的關(guān)注。作為鋅指蛋白(bZIP)Cap‘n'Collar家族中的一員，在激活很多編碼抗氧化酶和Ⅱ相代謝

5、酶表達(dá)的過程中起著重要的調(diào)控作用，其調(diào)控作用通過抗氧化物反應(yīng)元件(antioxidant responseelements，ARE)實(shí)現(xiàn)。在激活Nrf2的外源性同類物中，CUR的激活效應(yīng)受到了廣泛關(guān)注。
　　 本研究擬選用新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes，AST)建立氧化應(yīng)激神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，并以姜黃素為干預(yù)物，擬從細(xì)胞活力、細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激、能量代謝等幾方面，探究CUR對(duì)AN所致AST損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制，為

6、探討AN神經(jīng)毒作用機(jī)制提供生化基礎(chǔ)，為AN職業(yè)防護(hù)保健食品的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)也為姜黃素防治神經(jīng)退行性疾病及神經(jīng)毒性化學(xué)物職業(yè)接觸人群的化學(xué)防護(hù)提供參考。
　　 研究方法：進(jìn)行大鼠AST原代培養(yǎng)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，溶劑對(duì)照組，AN染毒組(1.0mmol/L處理12h)和不同濃度CUR預(yù)處理組(2umol/L、5umol/L、10umol/L、20umol/L)。MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力；LDH(1actate dehydr

7、ogenase)漏出試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒性；生化實(shí)驗(yàn)觀察氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量，過氧化氫酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；以熒光素DCF-DA為探針采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和微孔板熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量；應(yīng)用細(xì)胞色素C還原法檢測(cè)細(xì)胞色素C氧化酶(CycOx)的活性；采用免疫細(xì)胞化學(xué)

8、熒光法直接觀察Nrf2定位，并將細(xì)胞核、漿分離后Westernblot評(píng)價(jià)Nrf2核轉(zhuǎn)位情況；采用Western Blot檢測(cè)Nrf2，Keapl，HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)變化；RT-PCR檢測(cè)Nrf2、HO-1和γ-GCS基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化。
　　 研究結(jié)果：
　　 1)與空白細(xì)胞相比，AN染毒導(dǎo)致AST活力明顯下降(P＜0.05)；而經(jīng)CUR預(yù)處理之后，在其濃度＞5umol/L時(shí)細(xì)胞活力明顯升高(P＜0.

9、05)。
　　 2)與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，AN單獨(dú)作用后LDH漏出顯著增加(P＜0.05)，而CUR預(yù)處理之后，LDH漏出顯著降低(P＜0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。
　　 3)與空白組相比，AN染毒后AST MDA含量顯著升高(P＜0.05)，ROS生成顯著增多(P＜0.05)，GSH顯著下降(P＜0.05)，CAT活性明顯降低(P＜0.05)，SOD活性略有下降(P＞0.05)；而CUR預(yù)處理顯著抑制AN誘導(dǎo)MDA

10、和ROS升高(P＜0.05)，CUR濃度＞2umol/LCUR顯著抑制GSH下降(P＜0.05)，而僅有20umol/LCUR顯著提高了SOD和CAT活性(P＜0.05)。
　　 4)AN染毒后CycOx酶活性明顯降低，與空白組比有顯著性差異(P＜0.05)，而經(jīng)CUR預(yù)處理的AST，濃度為5umol/L時(shí)酶活就已顯著高于AN損傷組(P＜0.05)，且隨著CUR劑量的增加酶活升高的趨勢(shì)越來越明顯，漸漸恢復(fù)到正常細(xì)胞水平。

11、　　 5)免疫熒光結(jié)果顯示，AN損傷AST后，Nrf2核轉(zhuǎn)位略有增加與空白對(duì)照相組比(P＞0.05)；而經(jīng)10umol/LCUR預(yù)處理之后，Nrf2由胞質(zhì)大部分進(jìn)入胞核(P＜0.05)，Western blot結(jié)果也發(fā)現(xiàn)CUR上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá)，并且RT-PCR結(jié)果也顯示Nrf2 mRNA表達(dá)增加。然而Keapl蛋白并未見明顯變化。
　　 6)RT-PCR結(jié)果顯示與空白組比，AN損傷的AST Nrf2下游的Ⅱ相解毒酶基因和抗

12、氧化酶基因γ-GCS和HO-1mRNA表達(dá)略有升高(P＞0.05)，但經(jīng)CUR預(yù)處理以后，隨著CUR劑量的升高mRNA表達(dá)也逐漸增加，在濃度＞5umol/L時(shí)呈現(xiàn)出顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。同時(shí)免疫印跡結(jié)果顯示，AN染毒略微上調(diào)γ-GCS和HO-l蛋白表達(dá)(P＞o.05)，而CUR預(yù)處理濃度＞5umol/L便顯著上調(diào)了這兩種蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：姜黃素能夠顯著的提高星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力，減輕細(xì)胞毒性