Kallikrein 6和Kallikrein 10基因與胃腸道腫瘤生物學(xué)特性的研究.pdf

1、研究背景與目的：侵襲轉(zhuǎn)移是胃腸道腫瘤病人預(yù)后不能顯著改善的主要原因之一。早期診斷和正確預(yù)后判斷，提供個性化治療方案是腫瘤治療的重要策略。迄今尚缺乏胃腸道腫瘤特異性的診斷和預(yù)后判斷標志物，新型腫瘤差異表達蛋白及其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的關(guān)系已成為研究熱點。蛋白酶誘導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境降解是激發(fā)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的早期事件。人組織Kallikrein(KLK)家族是新近發(fā)現(xiàn)的編碼絲氨酸蛋白酶(hKs)的一組同源基因，受類固醇激素調(diào)控。內(nèi)分泌相關(guān)腫瘤

2、中KLKs的表達及其功能被異常調(diào)控，并與病人預(yù)后相關(guān)，可作為潛在腫瘤標志物。hKs可能通過降解細胞外基質(zhì)(ECM)、促進腫瘤細胞增殖及血管生成在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起作用，主要有hKl、hK6、hK7、hK8、hKl0和hKl4。研究表明hK6和hKlO在腫瘤KLKs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起重要作用，而其在胃腸道腫瘤中的表達模式、生物學(xué)功能尚無文獻報道。為此，本課題研究KLK6和KLKlO在胃腸道腫瘤中的表達及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，并研究雌激素對

3、其調(diào)控作用及相關(guān)機制；通過RNA干擾沉默KLK6基因探討其與大腸癌細胞增殖、侵襲及黏附等生物學(xué)特性的關(guān)系；進而研究KLKl、KLK7、KLK8和KLKl4在胃癌中的表達，探討其與KLKlO與KLK6表達的關(guān)系，從而系統(tǒng)研究KLKs與胃腸道腫瘤生物學(xué)特性的關(guān)系。 材料與方法：選取上海瑞金醫(yī)院普外科從2003年3月至2005年1月63對大腸癌和正常組織標本及36對胃癌和正常胃組織標本，熒光定量PCR技術(shù)檢測KLK6和KLKl0 mR

4、NA表達，Western blot和免疫組化驗證蛋白表達及定位，并分析基因組單核苷酸多肽性(SNP)，探討其與胃腸道腫瘤臨床病理特征的關(guān)系；抽取1996年1月至1998年1月行大腸癌根治術(shù)且接受正規(guī)隨訪的69例大腸癌病例，免疫組化染色結(jié)合圖像定量分析檢測hK6蛋白表達與大腸癌5年總生存率和無瘤生存率的關(guān)系；通過雌二醇刺激及拮抗試驗，研究雌二醇對大腸癌細胞株COL0205 KLK6和KLKlO基因表達的調(diào)控作用及與雌激素受體(ER)的關(guān)系

5、；通過構(gòu)建siRNA表達載體沉默KLK6基因表達，探討KLK6基因與大腸癌細胞株HCTl16體外增殖、侵襲、黏附及體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的關(guān)系；熒光定量PCR檢測胃癌組織KLKl、KLK7、KLK8、KLKl4的表達，探討其與胃癌臨床病理特征及KLK6和KLKl0表達的關(guān)系。 結(jié)果：(1)KLK6和KLKl0在胃腸道腫瘤組織中異常高表達，且與腫瘤臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，hK6表達與大腸癌病人的108個月無瘤生存率和總生

6、存率均顯著相關(guān)；KLKl0基因組測序未發(fā)現(xiàn)突變，而第3外顯子第50密碼子有GCC(丙胺酸)-TCC(絲氨酸)改變，第4外顯子有4處SNPs，位于密碼子106、112、141和149，其中149可引起CCG(脯氨酸)-CTG(亮氨酸)改變；(2)大腸癌細胞株LoVo、SWlll6、SW480、COLO2O5、HCTll6和HT29均表達ERJ3而不表達ERa，終濃度10<'-8>mol／L雌二醇刺激24h、72h后COLO205細胞的KL

7、K10表達顯著增強；10<'-6>mol／L雌激素拮抗劑ICI 182780可拮抗雌二醇對COLO205細胞KLKl0的上調(diào)作用；不同濃度雌二醇對COLO205細胞KLK6 mRNA表達無調(diào)控作用；(3)轉(zhuǎn)染KLK6 siRNA表達載體(pRNAT-U6.1／Neo-KLK6 siRNA)的HCTl16細胞，其KLK6在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達均被顯著抑制；KLK6基-因沉默的HCTll6細胞體外增殖和侵襲能力均被顯著抑制，而體外黏附能力無

8、顯著改變，在裸鼠腹腔內(nèi)成瘤轉(zhuǎn)移能力減弱；(4)胃癌組織中KLK8和KLK7 mRNA表達顯著高于正常胃組織，KLKl4則在胃癌中表達顯著下調(diào)，胃癌和正常胃組織的KLKl表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；KLK8表達與胃癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，KLK7表達與胃癌浸潤深度顯著相關(guān)；KLK7 mRNA表達與KLKlO mRNA表達呈顯著正相關(guān)，KLKl4 mRNA表達與KLK6 mRNA表達呈顯著負相關(guān)。 結(jié)論：KLKlO和KL,K6可作為胃