過氧亞硝酸陰離子在肝性腦病中作用的研究.pdf

1、目的:
　　 肝性腦病(hepatic encephalopathy,HE)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病,有關(guān)其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。眾所周知,HE病人血液中內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子升高,這兩者均是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的促進(jìn)劑。NOS被激活,促進(jìn)一氧化氮(nitric oxide,NO)的合成,使體內(nèi)NO大量增加,而且由于抗氧化防御能力下降,體內(nèi)超氧陰離子自由基(superoxide ani

2、on,O2)也常見升高。NO與O2會(huì)迅速反應(yīng)生成過氧亞硝酸陰離子(peroxynitrite,ONOO),該反應(yīng)幾乎不可逆,因而HE病人體內(nèi)ONOO可能異常增高。由于異常增高的ONOO可特異性使蛋白質(zhì)酪氨酸(tyrosine,Tyr)殘基硝基化而直接影響到蛋白質(zhì)的功能;可使神經(jīng)元細(xì)胞膜氧化從而導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙;可能造成肝、腦細(xì)胞線粒體破壞及能量合成障礙等,所以,在HE發(fā)病過程中,ONOO的作用不能排除。因此本研究通過對(duì)臨床肝損傷病人

3、及大鼠HE模型血清氧化/硝基化指標(biāo)的檢測(cè),探討ONOO在HE的發(fā)生發(fā)展中的作用,揭示ONOO的致病機(jī)制,為HE病因的研究及其治療提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1.對(duì)臨床肝損傷病人的研究
　　 1.1研究對(duì)象的選取與分組選取同一時(shí)期根據(jù)衛(wèi)生部病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)明確診斷的病毒性肝炎伴HE患者45例和病毒性肝炎非HE患者30例以及同一時(shí)期的健康查體者30例,根據(jù)疾病嚴(yán)重程度將其分為3組:病毒性肝炎伴

4、HE組,病毒性肝炎非HE組,健康對(duì)照組。HE的診斷:病毒性肝炎患者除肝功能嚴(yán)重?fù)p傷外,臨床上出現(xiàn)一系列無其他原因可解釋的神經(jīng)精神癥狀,并按下列條件分期:Ⅰ期:前驅(qū)期,Ⅱ期:昏迷前期,Ⅲ期:昏睡期,Ⅳ期:昏迷期。
　　 1.2各種生化指標(biāo)的測(cè)定空腹采血,離心分離后取血清。用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)血清中3-硝基酪氨酸(3-NT)含量;硫代巴比妥酸法檢測(cè)血清中丙二醛(MDA)含量;黃嘌呤氧化物酶法檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶(SOD

5、)的活力。
　　 2.對(duì)大鼠HE模型的研究
　　 2.1.大鼠HE模型的建立及分組用硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)建立大鼠HE模型。雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組(每組15只):空白對(duì)照組(Ⅰ)、HE模型組(Ⅱ)、依布硒啉處理組(Ⅲ)、溶劑對(duì)照組(Ⅳ)。除Ⅰ組外,其它各組第1d均腹腔注射TAA300 mg/kg,第2-4 d,每日分別注射TAA150 mg/kg,直至出現(xiàn)HE癥狀;Ⅰ組給予等量生理鹽水

6、腹腔注射。TAA處理組出現(xiàn)HE癥狀后,Ⅲ組每天經(jīng)口灌胃依布硒啉1mL/100g,Ⅰ組和Ⅱ組灌胃等量生理鹽水,Ⅳ組灌胃等量0.5％二甲基亞砜(DMSO)。
　　 2.2.各種生化指標(biāo)的測(cè)定各組大鼠于TAA處理前斷尾法取血;采用TAA處理后,TAA處理組大鼠出現(xiàn)Ⅱ期HE癥狀時(shí),各組大鼠斷尾取血;灌胃處理后,在Ⅱ組大鼠出現(xiàn)Ⅲ期或Ⅳ期HE癥狀后,各組大鼠均斷頭處死,取血。用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)血清中3-NT含量;賴氏法檢測(cè)血清中

7、ALT的活力;硫代巴比妥酸法檢測(cè)血清中MDA含量;黃嘌呤氧化物酶法檢測(cè)血清中SOD的活力。
　　 2.3.組織病理切片的制作及染色各組大鼠斷頭處死后取肝組織,制作石蠟切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色觀察組織病理改變。
　　 結(jié)果:1.臨床生化指標(biāo)分析1.1 HE病人血清中3-NT、SOD和MDA的檢測(cè)結(jié)果病毒性肝炎伴HE組病人血清生化指標(biāo)與病毒性肝炎非HE組比較:病毒性肝炎伴HE組病人血清中3-NT的含量明顯升高(P＜0.01

8、),SOD的活性顯著降低(P＜0.01),MDA的含量明顯升高(P＜0.01)。病毒性肝炎非HE組病人血清生化指標(biāo)與健康對(duì)照組比較:病毒性肝炎非HE組病人血清中3-NT的含量顯著升高(P＜0.01),SOD活性明顯降低(P＜0.01),MDA的含量顯著升高(P＜0.01)。
　　 1.2不同時(shí)期HE病人血清中3-NT、SOD和MDA的檢測(cè)結(jié)果病毒性肝炎伴HE組病人Ⅰ-Ⅱ期與Ⅲ-Ⅳ期血清中各生化指標(biāo)的差異均具有顯著性(P＜0.01

9、)。隨HE病情加重,病人血清中3-NT的含量升高(P＜0.01),SOD的活性降低(P＜0.01),MDA的含量升高(P＜0.01)。
　　 1.3 HE病人血清中3-NT和SOD、MDA的相關(guān)性分析 HE病人血清中3-NT和SOD、3-NT和MDA之間存在明顯相關(guān)性(P＜0.05),其中3-NT含量和SOD活性呈負(fù)相關(guān)。
　　 2大鼠一般狀態(tài)及解剖觀察腹腔注射TAA2 d后,即可出現(xiàn)HEⅠ期或Ⅱ期癥狀。根據(jù)每只大鼠的具

10、體情況減量注射TAA后,在3-7 d內(nèi),可繼續(xù)發(fā)展至Ⅲ期或Ⅳ期癥狀直至死亡。Ⅲ組大鼠在出現(xiàn)HE癥狀后灌胃依布硒啉,發(fā)現(xiàn)HE的發(fā)展速度減緩、癥狀減輕,存活時(shí)間延長。Ⅳ組大鼠在出現(xiàn)HE癥狀后灌胃DMSO,其病情進(jìn)展基本同Ⅱ組。
　　 3大鼠血清生化指標(biāo)分析
　　 3.1 HE大鼠血清生化指標(biāo)的自身前后對(duì)照出現(xiàn)HE癥狀后,血清中3-NT的含量較造模前顯著增加(P＜0.01);ALT的活性明顯增高(P＜0.01);SOD的活性降

11、低(P＜0.05),MDA的含量顯著增加(P＜0.01)。
　　 3.2 HE大鼠與正常大鼠血清生化指標(biāo)的比較出現(xiàn)HE癥狀后,Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組大鼠各血清指標(biāo)與Ⅰ組相比:3-NT和MDA的含量均顯著高于Ⅰ組(P＜0.01);ALT的活性明顯高于Ⅰ組(P＜0.01);SOD的活性顯著低于Ⅰ組（P＜0.05),排除了飲食及腹腔注射刺激等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
　　 3.3藥物處理后各組大鼠血清生化指標(biāo)的比較藥物處理后,Ⅱ組和Ⅳ

12、組3-NT、ALT和MDA的含量顯著高于Ⅰ組和Ⅲ組(P＜0.01);Ⅱ組和Ⅳ組、Ⅰ組和Ⅲ組之問各指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Ⅱ組和Ⅳ組SOD的活性顯著低于Ⅰ組和Ⅲ組(P＜0.01),Ⅱ組和Ⅳ組、Ⅰ組和Ⅲ組之間大鼠血清中SOD活性的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.4各組大鼠不同時(shí)期血清生化指標(biāo)的比較Ⅰ組大鼠在不同HE時(shí)期血清生化指標(biāo)的比較:Ⅰ組大鼠在各種處理前后各血清指標(biāo)的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

13、05);Ⅱ組和Ⅳ組大鼠在不同HE時(shí)期血清生化指標(biāo)分析結(jié)果的比較:Ⅱ組和Ⅳ組大鼠在出現(xiàn)HE癥狀后血清中各生化指標(biāo)的含量及活性與腹腔注射TAA前比較:3-NT和MDA的含量顯著升高(P＜0.01),ALT的活性顯著增強(qiáng)(P＜0.01),SOD的活性降低(P＜0.05);用藥后血清各生化指標(biāo)的含量及活性與用藥前比較:3-NT和MDA的含量顯著升高(P＜0.01),ALT的活性明顯增強(qiáng)(P＜0.01),SOD的活性降低(P＜0.05);Ⅲ組大鼠

14、在不同HE時(shí)期血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的比較:Ⅲ組大鼠出現(xiàn)HE癥狀后血清中各生化指標(biāo)的含量及活性與腹腔注射TAA前相比:3-NT和MDA的含量顯著升高(P＜0.01),ALT的活性顯著增強(qiáng)(P＜0.01),SOD的活性降低(P＜0.05);用藥后血清中各生化指標(biāo)的含量及活性與用藥前相比:3-NT和MDA的含量顯著降低(P＜0.01),ALT的活性明顯降低(P＜0.01),SOD的活性增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　 4.大鼠病理學(xué)觀察結(jié)

15、果Ⅱ組和Ⅳ組大鼠肝細(xì)胞有不同程度的壞死、崩解及消失,未壞死細(xì)胞也有嚴(yán)重變性,壞死組織中有較多的炎性細(xì)胞浸潤。隨HE分期越高,肝臟的病理改變?cè)矫黠@。Ⅲ組肝細(xì)胞形態(tài)與Ⅰ組相比,肝細(xì)胞體積增大,肝小葉結(jié)構(gòu)未見明顯改變。
　　 結(jié)論:
　　 本次實(shí)驗(yàn)從臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面,從生化和組織病理學(xué)角度初步探討了ONOO在HE發(fā)病中的作用,ONOO的異常增多導(dǎo)致蛋白質(zhì)硝基化可能是HE的發(fā)病機(jī)制之一,提示ONOO的清除劑如依布硒啉等有益