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文檔簡介
1、組織因子途徑抑制物-2(tissuefactorpathwayinhibitor-2,TFPI-2)又稱胎盤蛋白-5(placerltaprotein-5,PP-5)和基質(zhì)相關(guān)絲氨酸蛋白酶抑制劑(matrixassociatedserineproteaseinhibitor,MSPI),是一種帶有kunitz型結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑,屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員。成熟的人TFPI-2由富含酸性氨基酸的N端、三個串聯(lián)的kuntiz結(jié)構(gòu)域
2、和富含堿性氨基酸的C端組成,能抑制胰蛋白酶、纖溶酶、糜蛋白酶、血漿緩激肽釋放酶、組織蛋白酶G和多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性,從而對抗多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。TFPI-2與同家族的組織因子途徑抑制物-1(TFPI-1)結(jié)構(gòu)相似,功能部分相同,也是一種重要的抗凝物質(zhì),對凝血因子Ⅶa(FⅦa)/組織因子(tissuefactor,TF)復(fù)合物和凝血因子Xa(FXa)等均有不同的抑制作用。但迄今為止,TFPI-2的生理功能尚不清楚,TF
3、PI-2與其它蛋白質(zhì)相互作用的信息也知之有限。
我們運用Matchmaker3酵母雙雜交系統(tǒng),構(gòu)建了pGBKT7/TFPI-2質(zhì)粒載體。以此質(zhì)粒為誘餌,從人胎腦cDNA文庫中篩選出了95個蛋白編碼基因,包括32個代謝相關(guān)基因(其中8個參與蛋白代謝,13個參與核酸代謝,11個參與糖代謝),21個信號傳導(dǎo)相關(guān)基因,5個細胞生長與生存相關(guān)基因,7個運輸相關(guān)基因,2個抗調(diào)亡相關(guān)基因,其余28個基因的功能不明確。通過分析相關(guān)蛋白的細胞定
4、位、已知功能及文庫載體在雙雜交系統(tǒng)中正確表達的可能性等,進一步確定了8個可能與TFPI-2有潛在相互作用的蛋白。
在此研究基礎(chǔ)上,我們選擇了RASSF1C和ASB兩個蛋白,以確定它們與TFPI-2是否存在相互作用。ASB蛋白在成功拷貝基因,用PCR檢測了36個陽性克隆均無目的條帶。故我們將研究重點集中在確定TFPI-2是否與RASSF1C是否存在相互作用。
我們采用不同顏色的熒光表達載體,分別構(gòu)建了TFPI-2和RA
5、SSF1C的表達載體(融合表達),激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)兩者存在共定位,免疫共沉淀方法確定TFPI-2與RASSF1C存在相互作用。
絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Ste20家族涉及多種信號通路,包括參與控制細胞遷移和極性的信號通路。Ste20家族可分為p21活化蛋白激酶(p21-activatedkinases)和生發(fā)中心激酶(germinalcenterkinases,GCK)兩個亞家族。GCK可進一步分為八個亞群,其中2和3亞
6、群包括哺乳動物Ste20(mst)蛋白激酶、MST1、MST2、MST3、MST4和酵母Sps1/Ste20相關(guān)激酶1(YSK1,哺乳動物同源基因為SOK1)。YSK1也被稱為Ste20氧化應(yīng)激反應(yīng)蛋白激酶1,可被活性氧中間體弱激活,但不能由任何其它環(huán)境壓力,或生長因子激活。然而,該激酶不參與任何已知的蛋白激酶(MAPK)通路,且YSK1的生理功能不明。同YSK1一樣,MST4過表達不能激活JNK和p38激酶途徑,但可促進非錨定依賴性增
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