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1、目的:基于Ion Torrent PGM深度測(cè)序技術(shù)建立一種快速、敏感的乙型肝炎病毒(hepatitisB virus,HBV)突變定量檢測(cè)方法,描述HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV增強(qiáng)子Ⅱ(enhancerⅡ,EnhⅡ)、基本核心啟動(dòng)子(basal core promoter,BCP)、前C(precore,PC)區(qū)突變準(zhǔn)種特征,明確HBV病毒變異與病毒和宿主因素間的關(guān)系,探討干擾
2、素序貫治療過(guò)程中BCP突變動(dòng)態(tài)演進(jìn)模式及其對(duì)干擾素抗病毒治療應(yīng)答的影響。
方法:(1)構(gòu)建深度測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)品:
克隆測(cè)序篩選HBV BCP1762/1764和PC1896突變型和野生型參考質(zhì)粒,將突變型和野生型參考質(zhì)粒按比例(0%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、25%、50%和100%)混合,構(gòu)建系列梯度的HBV突變標(biāo)準(zhǔn)品。
(2)構(gòu)建深度測(cè)序文庫(kù):
巢式PCR擴(kuò)增HBV EnhⅡ、BCP、
3、PC區(qū)片段,PCR產(chǎn)物純化,2100生物分析儀定量檢測(cè)擴(kuò)增子濃度,準(zhǔn)備等摩爾比例的混合文庫(kù),構(gòu)建測(cè)序模板,標(biāo)準(zhǔn)品及臨床樣本IonTorrent PGM深度測(cè)序。
(3)生物信息學(xué)分析HBV EnhⅡ、BCP和PC區(qū)突變位點(diǎn)及其突變率。
結(jié)果:(1)Ion Torrent PGM深度測(cè)序在1%-100%突變范圍內(nèi)具有較高的準(zhǔn)確性(R2>0.99)和重復(fù)性(SE<1%)。
(2)HBV EnhⅡ、BCP和PC區(qū)
4、12個(gè)突變位點(diǎn)的流行率達(dá)20%以上。其中,G1719T、T1753V、A1762T和G1764A與C基因型相關(guān),而A1726C和A1752G/T與B基因型相關(guān)。15個(gè)核苷酸位點(diǎn)的突變引發(fā)了氨基酸改變。
(3)BCP A1762T/G1764A雙突變常伴PC1896野生型或低頻PC G1896A突變。
(4)高頻BCP A1762T/G1764A突變(≥50%)與較低的HBeAg和HBsAg水平相關(guān);PC G1896A
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