T-bet和c-FLIP雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及生物學(xué)活性檢測(cè).pdf

1、腫瘤組織通過(guò)分泌的抑制性細(xì)胞因子可抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答；腫瘤細(xì)胞又可通過(guò)高表達(dá)Fas-L，誘導(dǎo)Fas-L陽(yáng)性的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞凋亡，這兩者都被認(rèn)為與腫瘤逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視密切相關(guān)，而糾正此種免疫逃逸則是腫瘤免疫治療的重要機(jī)制和思路。T-bet是調(diào)節(jié)Th1型細(xì)胞免疫的關(guān)鍵因子：c-FLIPs能夠抑制腫瘤細(xì)胞引起的凋亡信號(hào)的傳遞。兩者的聯(lián)合應(yīng)用，一是提高Th1細(xì)胞數(shù)量，將有利于腫瘤患者失衡的Th1/Th2比例的恢復(fù)；同時(shí)，減少或避免活化的

2、CTL的凋亡，均有利于細(xì)胞免疫功能的增強(qiáng)，有利于促進(jìn)抗腫瘤免疫，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。本課題的研究思路和立題依據(jù)就是通過(guò)轉(zhuǎn)T細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet基因調(diào)整Th1/Th2比例失衡，運(yùn)用轉(zhuǎn)入c-FLIP基因調(diào)控CTL的細(xì)胞凋亡，探討c-FLIP基因?qū)TL細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及對(duì)其抗瘤效應(yīng)的影響，以期進(jìn)一步闡明CTL細(xì)胞凋亡及抗凋亡的機(jī)制，為惡性腫瘤的過(guò)繼免疫治療提供更高效、特異的免疫活性細(xì)胞，為腫瘤的防治提供新的手段和方案。 第

3、一部分人Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet基因表達(dá)載體的構(gòu)建免疫偏移(Th1/Th2)在腫瘤細(xì)胞免疫耐受中起著重要作用。因此，提高Th1細(xì)胞數(shù)量，將有利于腫瘤患者失衡的Th1/Th2比例的恢復(fù)，有利于細(xì)胞免疫功能的增強(qiáng)，有利于促進(jìn)抗腫瘤免疫，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。T-bet(T box expressed in T cells，T-bet)作為Th1特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在Th1細(xì)胞的分化中起著決定性的作用。因此，有望通過(guò)構(gòu)建表達(dá)T-bet

4、基因的真核表達(dá)載體，調(diào)控Th1細(xì)胞分化，有利于糾正腫瘤患者的免疫偏移。目的：構(gòu)建表達(dá)T-bet基因的真核載體。 方法：采用RT-PCR方法從人外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增T-bet cDNA序列并測(cè)序；利用載體pEGFP-C1，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1．T-bet及檢測(cè)。 結(jié)果：從淋巴細(xì)胞中提取的RNA質(zhì)量較好，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出目的基因T-bet大小為1608bp并測(cè)序證實(shí)。 結(jié)論：成功構(gòu)建表達(dá)T-bet

5、基因的真核表達(dá)載體。 第二部分腺病毒介導(dǎo)c-FIriPs基因誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞抗凋亡作用許多腫瘤細(xì)胞高表達(dá)Fas-L，誘導(dǎo)Fas<'+>的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞調(diào)亡，以躲避機(jī)體的免疫攻擊。c-FLIP能抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒pAdeasy系統(tǒng)構(gòu)建含有c-FLIPs基因的重組腺病毒，觀察其體外誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡作用。 方法：采用RT-PCR的方法，從人T淋巴細(xì)胞株的總RNA中克隆c-FLIPs基因；通過(guò)pAd

6、easy系統(tǒng)，構(gòu)建表達(dá)c-FLIPs的重組腺病毒Ad．c-FLIPS；Hochest染色法及FCM法檢測(cè)anti-Apo-1誘導(dǎo)感染Ad．c-FLIPs后的H9細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：采用RT-PCR方法從人T淋巴細(xì)胞株中擴(kuò)增出c-FLIPS基因；構(gòu)建重組腺病毒Ad.c-FL,IPs；經(jīng)Hoechst染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)DNA的形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)anti-Apo-1誘導(dǎo)凋亡處理24h后，未經(jīng)Ad.c-FLIPs感染的H9細(xì)胞有

7、大量的細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞；Ad.c-FLIPs感染的H9細(xì)胞中細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的細(xì)胞數(shù)明顯減少，大部分細(xì)胞染色質(zhì)呈彌漫均勻低強(qiáng)度熒光；流式細(xì)胞儀分析經(jīng)PI染色后的H9細(xì)胞，未經(jīng)Ad.c-FLIPs預(yù)處理的H9細(xì)胞在anti-Apo-1作用24h后，細(xì)胞的凋亡率分別為48.33％±7.41％；經(jīng)Ad.c-FLIPs預(yù)處理1d的H9細(xì)胞，其細(xì)胞凋亡率分別下降到3.6％±0.21％。結(jié)論：重

8、組腺病毒Ad.c-FLIPs有效地誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的抗凋亡作用。 第三部分 T-bet和c-FLIP雙基因共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及生物學(xué)活性檢測(cè)研究顯示腫瘤組織多分泌Th2類細(xì)胞因子，Th2類細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)狀態(tài)是腫瘤免疫的機(jī)理之一。因此，促使荷瘤內(nèi)Th2向Th1逆轉(zhuǎn)，重新達(dá)到平衡，成為腫瘤免疫治療的新思路。Fas屬于細(xì)胞凋亡信號(hào)受體，與其配體FasL結(jié)合后誘導(dǎo)Fas所在細(xì)胞的凋亡。腫瘤通過(guò)Fas系統(tǒng)逃避機(jī)體的免疫攻擊，因此如何抑制腫瘤的Fas

9、反擊，并利用Fas系統(tǒng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡在腫瘤的免疫治療中具有重要意義。T-bet是一個(gè)重要的Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)節(jié)Th1型細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子；c-FLIP能夠抑制Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞，因此，構(gòu)建T-bet及c-FLIP基因共表達(dá)的真核載體，有望在誘導(dǎo)Th1細(xì)胞向Th1型細(xì)胞分化的同時(shí)，產(chǎn)生抗腫瘤誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞凋亡作用。 目的：構(gòu)建攜帶T-bet和c-FLIP雙基因的真核表達(dá)載體及檢測(cè)其生物學(xué)活性。方法：采用RT-

10、PCR方法從人外周血淋巴細(xì)胞的總RNA中擴(kuò)增出T-bet和c-FLIP cDNA，利用pIRES和pEGFP-C1，構(gòu)建T-bet和c-FLIP雙基因真核表達(dá)載體pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP。采用非脂質(zhì)體的脂質(zhì)型介導(dǎo)載體將pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP轉(zhuǎn)染至外周血淋巴細(xì)胞，觀察T-bet和c-FLIP在外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)，并檢測(cè)其誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的抗凋亡作用及Th1/Th2細(xì)胞偏移。 結(jié)果：成功構(gòu)建

11、pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP質(zhì)粒，運(yùn)用非脂質(zhì)體的脂質(zhì)型介導(dǎo)載體將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染率為34.6％。流式細(xì)胞儀分析未經(jīng)pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP預(yù)處理的淋巴細(xì)胞在CH-11作用24h后，細(xì)胞的凋亡率分別為(50.12％±8.02％)：經(jīng)pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP預(yù)處理1d的淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞凋亡率分別下降到(5.73％±0.37％)；雙基因表達(dá)的淋巴細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ