炎癥因子對(duì)細(xì)胞膽固醇攝取與合成反饋調(diào)節(jié)組織特異性的改變：泡沫細(xì)胞形成的潛在新機(jī)制.pdf

1、目的:細(xì)胞內(nèi)的膽固醇無(wú)論是外源性攝入還是內(nèi)源性合成，均通過(guò)一個(gè)依賴于胞內(nèi)膽固醇水平的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的嚴(yán)密控制來(lái)保證膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，即主要通過(guò)SCAP-SREBPs-LDLr/HMGcoA reductase蛋白之間的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。過(guò)去的研究中，我們已經(jīng)證實(shí)炎性因子可以通過(guò)干擾膽固醇介導(dǎo)的低密度脂蛋白受體(LDLr)反饋調(diào)節(jié)來(lái)促進(jìn)外周細(xì)胞，如腎系膜細(xì)胞(HMCs)、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的膽固醇攝入，以及抑

2、制ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)基因的表達(dá)來(lái)減少膽固醇外流從而導(dǎo)致膽固醇在外周細(xì)胞異常積聚形成泡沫細(xì)胞。 本研究在我們過(guò)去研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選用HMCs和HepG2兩種細(xì)胞系，(1)探討在正常生理(非炎癥)及炎癥狀態(tài)下外周細(xì)胞和肝細(xì)胞LDLr反饋調(diào)節(jié)的組織特異性差異；(2)觀察炎癥因子是否影響人HMCs和HepG2細(xì)胞中HMGCoA還原酶(HMGCoA reductase)介導(dǎo)的內(nèi)源性膽固醇生物合成；同時(shí)探討炎癥反應(yīng)導(dǎo)致

3、細(xì)胞/機(jī)體對(duì)他汀類降脂藥物(HMGCoA還原酶活性抑制劑)抵抗的機(jī)制。(3)進(jìn)一步觀察炎癥因子對(duì)LDLr/HMGCoA還原酶的上游調(diào)控蛋白——核轉(zhuǎn)錄因子SREBP-2和膽固醇敏感器SCAP的影響，探討外周細(xì)胞HMCs和肝細(xì)胞HepG2膽固醇攝入與合成組織特異性差異的分子機(jī)制。 材料和方法:用酶學(xué)方法分別檢測(cè)HMCs和HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)，游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)的水平；油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況；用

4、<'14>C標(biāo)記的acetate(乙酸鹽，膽固醇合成原料、)孵育細(xì)胞，提取膽固醇，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定<'14>C含量，從而測(cè)定細(xì)胞膽固醇的合成；提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用real-time定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)兩種細(xì)胞LDLr、HMGCoA還原酶、SREBP-2和SCAP mRNA水平；用Western blotting檢測(cè)LDLr、HMGCoA還原酶蛋白表達(dá)水平；進(jìn)一步應(yīng)用薄層層析技術(shù)測(cè)定HMGcoA還原酶活性；抗人SCAP抗體和抗高爾

5、基抗體雙重染色后，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察兩種細(xì)胞SCAP-SREBP 復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的定位。 結(jié)果: 1．炎性因子IL-1β能明顯促進(jìn)外周細(xì)胞和肝細(xì)胞膽固醇的外源性攝入和內(nèi)源性合成，從而造成膽固醇(特別是膽固醇酯)在細(xì)胞內(nèi)異常積聚。外周細(xì)胞HMCs較肝細(xì)胞HepG2對(duì)炎癥因子更敏感。 2．正常生理(非炎癥)狀態(tài)下，當(dāng)細(xì)胞加載不同濃度低密度脂蛋白(LDL)時(shí)，可以反饋抑制兩種細(xì)胞的LDLr mRNA、蛋

6、白水平，其中HMCs細(xì)胞LDLr的下調(diào)比HepG2更敏感(“下調(diào)易感”)。此外，Compactin(一種他汀類降脂藥物，HMGCoA還原酶活性抑制劑)可以通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，促進(jìn)兩種細(xì)胞LDLr mRNA和蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)LDLr介導(dǎo)的外源膽固醇攝入，HepG2細(xì)胞中LDLr的上調(diào)比HMCs細(xì)胞更敏感(“上調(diào)易感”)。然而，炎癥狀態(tài)下，IL-1β能干擾LDL對(duì)LDLr的下調(diào)作用，促進(jìn)兩種細(xì)胞，尤其是HMCs細(xì)胞的LDLr mR

7、NA和蛋白表達(dá)，使外周細(xì)胞像肝細(xì)胞一樣，能大量攝取膽固醇。同時(shí)，當(dāng)有炎性因子存在時(shí)，IL-1β能干擾Compactin對(duì)LDLr的上調(diào)作用，需要增加Compactin的劑量才能達(dá)到非炎癥狀態(tài)時(shí)同等的對(duì)LDLr上調(diào)效果。 3．正常生理(非炎癥)狀態(tài)下，加載LDL可以反饋抑制兩種細(xì)胞的HMGCoA還原酶mRNA、蛋白表達(dá)以及酶活性，這種由于胞內(nèi)膽固醇水平升高而導(dǎo)致的反饋抑制作用，HMCs比HepG2細(xì)胞更敏感。然而，炎癥狀態(tài)下，炎性

8、因子IL-1β可以打破由胞內(nèi)膽固醇介導(dǎo)這種反饋調(diào)節(jié)，在HMCs細(xì)胞，炎性因子干擾HMGCoA還原酶反饋調(diào)節(jié)主要是通過(guò)增加HMGCoA還原酶mRNA、蛋白表達(dá)及酶活性水平來(lái)實(shí)現(xiàn)，而在HepG2細(xì)胞僅僅只增加HMGCoA還原酶的酶活性水平，對(duì)mRNA及蛋白表達(dá)影響不明顯。Cornpactin可以抑制HMCs與HepG2細(xì)胞HMGCoA還原酶的酶活性、上調(diào)mRNA 表達(dá)，然而當(dāng)有IL-1β存在時(shí)，Compactin抑制酶活性、上調(diào)mRNA表達(dá)

9、的作用均被明顯減弱。 4．進(jìn)一步，我們探討了IL-1β對(duì)LDLr/HMGCoA還原酶的上游調(diào)控蛋白——核轉(zhuǎn)錄因子SREBP-2和膽固醇敏感器SCAP的影響。LDL能降低SREBP-2和SCAP的mRNA水平，并抑制SCAP-SREBP復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)移，這種抑制作用在HMCs更明顯，而當(dāng)同時(shí)有IL-1β存在時(shí)，兩種細(xì)胞SREBP-2 mRNA表達(dá)均明顯增加，并且SCAP-SREBP復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)移明顯增多，

10、從而可以進(jìn)一步促進(jìn)靶基因LDLr/HMGCoA還原酶的轉(zhuǎn)錄。 結(jié)論:生理 (非炎癥)情況下，胞內(nèi)膽固醇水平可以對(duì)兩種細(xì)胞SCAP-SREBP-LDLr/HMGCoA 還原酶產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，HMCs 較HepG2 細(xì)胞更敏感，使得外周細(xì)胞相對(duì)于肝細(xì)胞能在胞內(nèi)膽固醇水平升高時(shí)更迅速地減少外源膽固醇攝取和內(nèi)源膽固醇合成，防止了膽固醇在外周細(xì)胞的聚集。但在炎癥狀態(tài)下，由膽固醇介導(dǎo)的SCAP-SREBP-LDLr/HMGCoA 還原酶的嚴(yán)