便秘大鼠結(jié)腸壁內(nèi)SP、NOS及Cajal間質(zhì)細(xì)胞損傷的可復(fù)性研究.pdf

1、目的：本課題在便秘大鼠模型建立后，進(jìn)行恢復(fù)性飼養(yǎng)，通過觀察其結(jié)腸壁內(nèi)Ca{alf司質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)以及NOS、SP免疫反應(yīng)性的變化，了解停用大黃后Caial間質(zhì)細(xì)胞以及NOS、SP陽性反應(yīng)細(xì)胞的恢復(fù)情況，探討Cajal間質(zhì)細(xì)胞、NOS、SP陽性反應(yīng)細(xì)胞在慢傳輸型便秘中的可逆轉(zhuǎn)性。 方法： 1、動物分組：選取健康Wistar大鼠120只，雌雄各半，按照完全隨機的方法進(jìn)行分組：便秘一組、便秘二組及對照組，各40只，分組后組間

2、體重、性別無顯著性差異。 2、動物處理：便秘一組及便秘二組采用大黃浸液灌胃，首日劑量為800mg/kg(生粉)，此后每日劑量在前一日基礎(chǔ)上增加200mg/kg(生粉)，直至出現(xiàn)半數(shù)大鼠糞便變稀，保持劑量至80％的大鼠稀便消失，繼續(xù)加量給藥，至又有半數(shù)大鼠糞便變稀，如此程序循環(huán)3次，待便秘一組及便秘二組第三次80％的大鼠稀便消失一周后停止建模。然后便秘一組繼續(xù)以維持量大黃灌胃，便秘二組以同等體積蒸餾水灌胃恢復(fù)性飼養(yǎng)，時間為1個月。

3、對照組自實驗開始以同等體積蒸餾水灌胃。 3、標(biāo)本取材：恢復(fù)性飼養(yǎng)1個月后分別選取便秘一組、便秘二組及對照組大鼠各20只，切取橫結(jié)腸中段腸壁組織二塊，分別石蠟包埋和環(huán)氧樹脂包埋。石蠟包埋組織切片后經(jīng)常規(guī)HE染色、NOS、SP及c-kit免疫組織化學(xué)染色。光鏡下觀察Cajal間質(zhì)細(xì)胞、腸神經(jīng)叢和免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的改變。環(huán)氧樹脂包埋標(biāo)本超薄切片，飽和醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及Cajal間質(zhì)細(xì)胞的胞內(nèi)形態(tài)學(xué)變化。

4、 4、半定量分析：根據(jù)NOS、SP免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元胞體和纖維的分布密度及活動性強弱，做相對半定量比較。所有視野未見陽性細(xì)胞為(-)；有少數(shù)陽性細(xì)胞為(+)，染色為淡黃色；陽性細(xì)胞較多見為(++)，染色為棕黃色；陽性細(xì)胞多見為(+++)，染色為棕褐色。 5、圖像分析：在CMIAS系列多功能病理圖像分析系統(tǒng)下，每組選5例染色良好的切片，在顯微鏡物鏡放大10倍下觀察，以肌間叢為中心每張切片隨機選取5個視野，共25個視野攝入

5、計算機(分辨率為800×600)，測量每個視野陽性染色區(qū)域的表面積密度，即面密度。最后計算每組的平均值。并用尼康光鏡照相機拍攝典型視野。 6、統(tǒng)計分析：本實驗資料數(shù)據(jù)采用x±s表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，選用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢驗水準(zhǔn)a=0.05。半定量分析結(jié)果采用Excel編程統(tǒng)計，檢驗方法選用成組設(shè)計多個樣本比較的秩和檢驗(Kmskal-Wallis法)及多個樣本兩兩比較的秩和檢驗(Nemenyi法)，檢驗

6、水準(zhǔn)a=0.05。 結(jié)果： 1、腸道HF染色：對照組大鼠腸道切片HE巳染色未發(fā)現(xiàn)病變，便秘一組大鼠腸道切片HE巳染色可見粘膜慢性炎癥改變，便秘二組大鼠腸道切片HE巳染色可見粘膜慢性炎癥改變較便秘一組大鼠減輕。 2、SP、NOS免疫組織化學(xué)結(jié)果： 2.1 SP 便秘一組免疫反應(yīng)性較對照組明顯降低(P<0.01)；便秘二組免疫反應(yīng)性較便秘一組明顯增高(P<0.01)，但低于對照組(P<0.0 1)。

7、 2.2 NOS 便秘一組免疫反應(yīng)性較對照組明顯增高(P<0.01)；便秘二組免疫反應(yīng)性較便秘一組明顯降低(P<0.01)，但高于對照組(P<0.01)。 3、對SP、NOS免疫組織化學(xué)圖像分析的結(jié)果與半定量分析一致。 4、c-kit免疫組織化學(xué)圖像分析： 便秘一組免疫反應(yīng)性較對照組明顯降低(P<0.01)；便秘二組免疫反應(yīng)性較對照組明顯降低(P<0.01)；便秘二組免疫反應(yīng)性較便秘一組稍有升高(P>0.0

8、5)。 5、電鏡： 對照組：Caial間質(zhì)細(xì)胞常見，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及膜內(nèi)陷空泡，與平滑肌細(xì)胞有縫隙連接；可見正常神經(jīng)元，其胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體。 便秘一組：未找到Caial間質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)元有明顯的退行性改變。 便秘二組：可找到少量Caial間質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)髓索、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞退行性變有所恢復(fù)。 結(jié)論： 1、長期應(yīng)用大黃導(dǎo)致的慢傳輸型便秘大鼠模型，可出

9、現(xiàn)粘膜慢性炎癥改變，固有膜水腫，肌層膠原纖維增生；肌間神經(jīng)叢神經(jīng)細(xì)胞空泡變性、減少。停用大黃恢復(fù)性飼養(yǎng)1個月后，粘膜炎癥改變出現(xiàn)一定程度恢復(fù)。 2、長期應(yīng)用大黃等葸醌類瀉劑對腸道神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的損害作用，腸道NOS反應(yīng)性升高，SP反應(yīng)性降低；停用大黃恢復(fù)性飼養(yǎng)1個月后腸道神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)恢復(fù)傾向。 3、長期應(yīng)用大黃導(dǎo)致的慢傳輸型便秘大鼠模型，出現(xiàn)Cajal間質(zhì)細(xì)胞的胞內(nèi)形態(tài)學(xué)變化，且數(shù)目減少，c-kit免疫反應(yīng)性明顯降低；停