帕潘立酮對MK-801損傷腦皮層神經(jīng)元的保護作用及機制研究.pdf

1、精神分裂癥是一種反復發(fā)作的慢性遷延性疾病，患病率約占世界總?cè)丝诘?％。患者往往表現(xiàn)為三種不同類型的癥狀:陽性癥狀（如妄想、幻覺），陰性癥狀和認知功能障礙（包括情感冷漠、社會退卻、注意力減退、空間記憶減退）等。精神分裂癥病因不明，發(fā)病機理復雜，其發(fā)病涉及多種學說、多條基因通路，但均不能完全解釋精神分裂癥的臨床表現(xiàn)，治療轉(zhuǎn)歸，該病的發(fā)病機理仍需要進一步的探索研究。
　　 MK-801，又名地佐環(huán)平，為非競爭性NMDA受體拮抗劑。NM

2、DA受體是谷氨酸受體的一個亞型，廣泛分布于大腦皮質(zhì)、丘腦、海馬、紋狀體和脊髓，參與中樞興奮性神經(jīng)沖動的傳導。MK-801通過阻斷非競爭性NMDA受體模擬精神分裂癥的陽性與陰性癥狀，而廣泛應用于精神分裂癥動物模型的建立。行為學研究應用MK-801制備的模型鼠感覺運動功能障礙，其學習和工作記憶、空間定位記憶能力均受到不同程度的損害，形態(tài)學檢測顯示腦皮層神經(jīng)元空泡化，神經(jīng)元胞體萎縮及樹突斷裂。體外研究表明，MK-801可降低小腦顆粒細胞的活性

3、，促進凋亡蛋白的表達進而誘導細胞凋亡，并能抑制神經(jīng)細胞突起的生長。國外學者曾應用MK-801損傷神經(jīng)元，并作為精神分裂癥的體外模型，分析相關的病理機制。
　　 非經(jīng)典抗精神病藥物又稱為第二代抗精神病藥物，與經(jīng)典抗精神分裂癥藥物相比，非經(jīng)典抗精神病藥物在臨床上得到廣泛應用得益于其在發(fā)揮治療精神分裂癥作用時較少引起錐體外系反應等副作用，同時非經(jīng)典抗精神病藥物能降低患者腦體積減少的程度，有效發(fā)揮神經(jīng)保護作用。帕潘立酮(paliperi

4、done)是一種新型的非經(jīng)典抗精神病藥物，其臨床治療效果明顯優(yōu)于經(jīng)典抗精神病藥物。研究發(fā)現(xiàn)帕潘立酮通過提高細胞存活率、降低凋亡蛋白而發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。然而，帕潘立酮發(fā)揮神經(jīng)元保護作用及其抗精神分裂癥機制還清楚，需要進一步的研究。
　　 鑒于此，我們設計以下實驗檢測帕潘立酮的神經(jīng)保護作用及其相關的分子學機制以及帕潘立酮抗精神分裂癥的相關機制。在體外實驗中，我們?nèi)〔腅15天胎鼠腦皮層神經(jīng)元，行微管相關蛋白2(MAP-2)免疫細胞化

5、學染色鑒定提取神經(jīng)元的純度，用不同濃度的MK-801毀損腦皮層神經(jīng)元，同時加入帕潘立酮進行處理，通過檢測神經(jīng)元活性、乳酸脫氫酶(LDH)的釋放、鈣離子濃度及timecourse來觀察其對神經(jīng)元的保護作用，通過神經(jīng)突起總長度及神經(jīng)突起密度計數(shù)檢測帕潘立酮對神經(jīng)突起生長的影響，在進一步的分子機制研究中檢測了與精神分裂癥密切相關的信號通路Akt1/GSK3β的表達變化，并應用該通路的抑制劑LY294002處理培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，通過Hoechs

6、t33342/PI染色及神經(jīng)元活性分析驗證帕潘立酮是否是通過Akt1/GSK3β信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護及抗精神分裂癥作用。體內(nèi)實驗中，我們運用MK-801建立精神分裂癥小鼠動物模型，并同時給予帕潘立酮藥物處理，通過動物行為學檢測、皮層組織Akt1/GSK3β蛋白表達的變化來分析帕潘立酮抗精神分裂癥作用及可能的分子機制。
　　 結果顯示，提取的胎鼠皮層神經(jīng)元純度高，絕大多數(shù)表達MAP-2。應用不同濃度的MK-801處理后，與正常對照

7、組相比，神經(jīng)元活性明顯下降，LDH釋放增多，神經(jīng)突起總數(shù)目及神經(jīng)突起密度均有不同程度的下降，細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高（P均＜0.01），鈣離子timecourse檢測顯示在360-720s時間范圍內(nèi)，細胞內(nèi)鈣離子熒光強度急劇升高(P＜0.01)，real-timePCR及western-blot檢測結果顯示Akt1/GSK3β信號通路表達下調(diào)(P＜0.01)。加入帕潘立酮共處理后，與MK-801組相比，帕潘立酮能明顯提高神經(jīng)元活性，促進

8、神經(jīng)突起的生長，降低LDH釋放及細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高（P均＜0.01），鈣離子timecourse檢測顯示在360-720s時間范圍內(nèi)，細胞內(nèi)鈣離子熒光強度的升高被明顯抑制(P＜0.01)，并能夠上調(diào)Akt1/GSK3β信號通路的表達。帕潘立酮與MK-801共培養(yǎng)加入LY294002后，可明顯抑制帕潘立酮的神經(jīng)保護作用。體內(nèi)結果顯示，應用MK-801可成功建立精神分裂癥小鼠動物模型，小鼠刻板性旋轉(zhuǎn)次數(shù)及平衡木穿梭次數(shù)顯著增加，額葉皮層