回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代謝作用及機制研究.pdf

1、目前全球有2.8億糖尿病患者，發(fā)病率逐年升高，并且表現(xiàn)出年輕化趨勢，其中90％是2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)，僅美國就有2800萬2型糖尿病患者，占到總?cè)丝?％。在2007年糖尿病死亡率位列第七位。目前研究認為2型糖尿病的發(fā)病是多因素的結(jié)果，尤其是以遺傳及不良生活習(xí)慣為主，而內(nèi)科相關(guān)治療手段，如增加運動量、限制食物攝取、使用降糖藥物及胰島素等，均不能使其根除。由于需要長期堅持治療甚至維持終生，患者依

2、從性差，使血糖水平不能維持在正常水平范圍之內(nèi)，導(dǎo)致各種并發(fā)癥的發(fā)生。2型糖尿病長期血糖控制不佳除了引起失明、腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及孕期并發(fā)癥外，還要面對持續(xù)高發(fā)的由于心肌梗死導(dǎo)致的充血性心力衰竭和死亡，而擴張性心肌病的發(fā)病率越來越高，有研究表明大約有60％的2型糖尿病患者表現(xiàn)心肌收縮功能的失調(diào)。糖尿病患者消耗大量公共醫(yī)療資源，醫(yī)療費用是正常非糖尿病患者的兩到三倍。美國每年為糖尿病患者投入1740億美元，預(yù)計到2020年要增加到1920億美

3、元，其中67％直接與糖尿病相關(guān)。因此，尋找安全、長效、依從性高的治療方法成為全球關(guān)注的熱點，而關(guān)于2型糖尿病相關(guān)治療機制值得深入探討。
　　 減肥手術(shù)（Bariatricsurgery）作為研究熱點，有越來越多的研究針對各種手術(shù)方式、短期或長期的葡萄糖穩(wěn)態(tài)的改善而進行。目前研究認為，減肥手術(shù)后患者通過能量攝入減少及胰島素相關(guān)胃腸道激素的分泌變化而改善血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)，最終起到血糖控制的作用?；啬c轉(zhuǎn)位術(shù)(Ilealtranspositi

4、on，IT)的理念首次在1982年被KoopmansHS等人在肥胖動物實驗?zāi)Ｐ椭刑岢?。而此術(shù)式首先在非肥胖型2型糖尿病大鼠中與其他術(shù)式（如胃旁路術(shù)，膽胰轉(zhuǎn)流術(shù)等）相比有效的縮短了手術(shù)操作以及術(shù)后恢復(fù)時間。另外，血糖控制改善常常發(fā)生于體重明顯減輕之前，預(yù)示手術(shù)在2型糖尿病改善中的直接作用，而不是繼發(fā)于體重減輕和肥胖消除。這些發(fā)現(xiàn)揭示了遠端回腸內(nèi)分泌激素機制可能參與了術(shù)后非肥胖2型糖尿病的恢復(fù)。同時，胰高血糖素樣肽(Glucagon-lik

5、epeptide-1，GLP-1)作為有效的胰島素釋放促進劑，已經(jīng)被實驗證實可以促進正常和缺血再灌注后心臟的葡萄糖攝取?；啬c轉(zhuǎn)位術(shù)延遲了近端腸管與攝入食物的接觸而促進回腸與食物接觸，保持了腸管的完整性，促進GLP-1的分泌，越來越多的實驗證據(jù)為回腸轉(zhuǎn)位術(shù)在促進2型糖尿病心肌胰島素信號通路及葡萄糖轉(zhuǎn)運改善方面提供可能。
　　 為研究回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對心肌糖代謝功能、胰島素信號通路及葡萄糖轉(zhuǎn)運可能的作用及機制，本課題采用自發(fā)性非肥胖2型糖

6、尿病Goto-Kakizaki(GK)大鼠為動物模型，首先確定GK大鼠在心肌糖代謝、胰島素信號及葡萄糖轉(zhuǎn)運方面的變化，行回腸轉(zhuǎn)位術(shù)并監(jiān)測術(shù)后系統(tǒng)性血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)、胰島β細胞功能及胃腸道激素等變化，然后進一步研究心肌葡萄糖攝取及胰島素信號通路重要蛋白，并行體外心肌細胞培養(yǎng)，以期為手術(shù)治療2型糖尿病改善心血管并發(fā)癥提供理論支持及治療依據(jù)。
　　 第一部分、非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代謝及胰島素信號變化
　　 非肥胖2型糖尿病GK

7、大鼠作為自發(fā)性糖尿病大鼠模型，表現(xiàn)輕度血糖升高，葡萄糖刺激的胰島素分泌功能受損，明顯的葡萄糖不耐受，外周胰島素抵抗，這些都可能導(dǎo)致心肌受損。我們首先驗證了GK大鼠心肌葡萄糖攝取功能，胰島素信號及葡萄糖轉(zhuǎn)運的變化。
　　 1.GK大鼠心肌胰島素刺激的葡萄糖攝取顯著低于對照鼠
　　 為研究心臟葡萄糖攝取的情況，我們收集各30只，8-10周齡GK大鼠及其對照大鼠Sprague-Dawley(SD)大鼠的新鮮心臟，首先進行心臟L

8、angendorff灌注清洗殘余血跡，然后在含有2D-3H-glucose的Krebs-Ringer's緩沖液中孵育一段時間后，加入胰島素或者對照試劑刺激，最終檢測心肌的葡萄糖攝取量。結(jié)果顯示在沒有胰島素刺激（對照試劑）的情況下，GK大鼠心肌細胞的葡萄糖攝取與對照組無異;但是胰島素刺激可以大大促進大鼠心肌的葡萄糖攝取，而GK大鼠心肌葡萄糖攝取量明顯低于對照組。提示GK大鼠心肌葡萄糖攝取功能受損。
　　 2.GK大鼠心肌胰島素信號

9、通路變化
　　 胰島素與胰島素受體(InsulinReceptor,IR)的結(jié)合可以引起胰島素信號通路一些列酪氨酸殘基的自身磷酸化，這些磷酸化的酪氨酸殘基可以被其銜接蛋白的ProteinTyrosineBindingdomain(PTB)結(jié)構(gòu)域識別，這其中以胰島素受體底物（InsulinReceptorSubstrate，IRS）蛋白為代表，這個過程引起了IRS蛋白重要酪氨酸殘基的磷酸化，從而導(dǎo)致被Phosphoinositid

10、e3-kinases(PI3K)等脂質(zhì)激酶激活而結(jié)合。本研究著重于此信號通路的重要蛋白的mRNA及總蛋白表達，各自的磷酸化及IRS-1結(jié)合的PI3K。我們收集胰島素或者葡萄糖刺激的GK大鼠及SD大鼠的新鮮心臟，提取總mRNA及蛋白質(zhì)，利用RT-PCR、免疫印跡(Westernblot)及免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation，Co-IP)檢測IR-β、IRS-1及其酪氨酸磷酸化、Akt(ProteinKinaseB)

11、總蛋白和磷酸化蛋白，以及胰島素刺激的IRS-1結(jié)合的PI3K蛋白總量的表達。
　　 2.1、胰島素受體β(IR-β)mRNA、總蛋白及其磷酸化蛋白表達降低
　　 胰島素受體作為跨膜的大分子蛋白，分為α、β兩個亞基，胰島素信號通路的激活，首先需要與α亞基結(jié)合而發(fā)生構(gòu)型變化，導(dǎo)致跨膜的β亞基酪氨酸磷酸化，從而引起下游一系列信號的激活。故IR-β的總量與其磷酸化在胰島素信號通路中起重要作用。本研究通過RT-PCR、Wester

12、nblot及免疫共沉淀等試驗證實在GK大鼠心臟中IR-βmRNA、蛋白總量及酪氨酸磷酸化降低，提示其心肌胰島素受體水平的降低，從而預(yù)示心肌胰島素信號可能存在受損情況。
　　 2.2、胰島素受體底物-1(IRS-1)mRNA、總蛋白及其磷酸化蛋白表達降低
　　 胰島素受體底物也與胰島素受體后水平的調(diào)節(jié)有關(guān)，其中IRS-1主要作用于橫紋?。ü趋兰　⑿募。?，而IRS-2則廣泛作用于肝臟、脂肪及骨骼肌等。有研究證實在IRS-1-

13、/-動物模型中，動物出現(xiàn)嚴重的胰島素外周抵抗，證實IRS-1在胰島素信號通路中的作用。本研究通過RT-PCR、Westernblot及Co-IP等試驗證實在GK大鼠心臟中胰島素受體底物mRNA、蛋白總量及酪氨酸磷酸化降低。胰島素受體后水平的降低，提示心肌胰島素受體酪氨酸激酶活化后的環(huán)節(jié)障礙。
　　 2.3、胰島素刺激的IRS-1/PI3K/Akt蛋白信號通路抑制
　　 IRS-1與PI3K蛋白的結(jié)合是胰島素發(fā)生代謝作用的

14、主要途徑。而胰島素受體/IRS/PI3K信號通路障礙，勢必引起下游代謝受影響。本研究通過新鮮心臟組織Co-IP實驗證實GK大鼠心臟中IRS-I/PI3K結(jié)合明顯降低，提示心肌胰島素代謝作用受損。
　　 Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又被稱蛋白激酶B(PKB)。作為IRS/PI3K信號通路下游的靶蛋白，其主要通過激活細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)來誘導(dǎo)細胞周期進展;對于細胞葡萄糖攝取方面，其通過增加葡萄糖轉(zhuǎn)運因子4(GLU

15、T4)的活性來實現(xiàn)，最終促進細胞生長;Akt活化后還可磷酸化糖原合成激酶3(GSK3)促進糖原合成，并可增加細胞無氧糖酵解水平。其對胰島素葡萄糖代謝起著重要作用，其磷酸化水平與其活性密切相關(guān)。本研究通過RT-PCR、Westernblot及Co-IP等實驗證實在GK大鼠心臟中Akt蛋白總量未變，而酪氨酸磷酸化降低，Akt活性的降低提示IRS/PI3K下游通路受損。
　　 3.GK大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達變化
　　 葡萄糖轉(zhuǎn)

16、運蛋白是細胞轉(zhuǎn)運葡萄糖的載體，其中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(GLUT1)廣泛的表達于各種組織，可以調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取并且具有較強的親和力;而GLUT4主要表達與脂肪組織和橫紋肌中（主要有心肌和骨骼?。?，在胰島素刺激的情況下，能夠有效的將葡萄糖及自身從細胞漿轉(zhuǎn)運到細胞膜上，從而促進胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運。有研究表明在Akt及PI3K都可以促進GLUT4的易位。為進一步研究GK大鼠葡糖糖代謝通路的變化，本研究收集大鼠的新鮮心肌，提取組織總mRNA、

17、總蛋白及膜蛋白，采用RT-PCR、Westernblot方法，檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達。結(jié)果證實葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4蛋白表達總量與對照鼠一致，而葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4膜蛋白表達量明顯低于對照組SD大鼠，提示GK大鼠心肌葡萄糖轉(zhuǎn)運能力下降。
　　 第二部分、回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病大鼠血糖穩(wěn)態(tài)及心肌葡萄糖糖攝取作用
　　 回腸轉(zhuǎn)位術(shù)是將遠端10cm回腸切除并吻合到近端空腸，人為復(fù)制如Roux

18、-en-Y胃旁路術(shù)(RYGB)和膽胰轉(zhuǎn)流術(shù)(Biliopancreaticdiversion，BPD)手術(shù)后未消化的食糜提前到達接觸遠端回腸模型。此手術(shù)模型不會引起明顯的營養(yǎng)不良或胃容量限制而引起研究者的興趣。有研究顯示，回腸轉(zhuǎn)位術(shù)可以明顯促進鏈脲佐菌素誘導(dǎo)SD糖尿病大鼠的胰島素分泌，并且顯著增加血清腸內(nèi)分泌激素，如GLP-1、多肽YY激素(PYY)等濃度;也有試驗顯示回腸轉(zhuǎn)位術(shù)后早期（10-45天）非肥胖型糖尿病大鼠胰島素抵抗得到改善

19、。為驗證遠端回腸在早期及長期葡萄糖耐受、血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)及胰島β細胞功能改善方面是否起作用，并且與動物攝食及體重的改變的關(guān)系;同時，為探索回腸轉(zhuǎn)位術(shù)在心肌葡萄糖攝取的作用，本研究采用非肥胖2型糖尿病GK大鼠進行回腸轉(zhuǎn)位術(shù)并進行一系列相關(guān)指標(biāo)的探索。
　　 1.動物模型的評價
　　 雄性8-10周齡GK大鼠及相應(yīng)同齡SD大鼠，術(shù)前常規(guī)檢測進食量、體重、空腹血糖濃度，評估糖尿病模型及對照組的穩(wěn)定性，其中空腹血糖≥7.0mmol/L

20、，2h血糖≥11.1mmol/L的GK大鼠分為糖尿病手術(shù)組與糖尿病假手術(shù)組，SD大鼠皆為非糖尿病對照組。
　　 1.1、術(shù)前手術(shù)組與假手術(shù)組評價
　　 常規(guī)術(shù)前檢測糖尿病手術(shù)組與糖尿病假手術(shù)組食物攝取、體重、空腹血糖濃度、口服糖耐量實驗(OGTT)、胰島素抵抗(ITT)，同時監(jiān)測胰島素β細胞功能（餐前后血清胰島素、葡萄糖刺激的C肽）、胃腸內(nèi)分泌激素(GLP-1、GIP、PYY)分泌量，發(fā)現(xiàn)術(shù)前手術(shù)組與假手術(shù)組皆沒有明顯差

21、異。
　　 1.2、術(shù)后手術(shù)組與假手術(shù)組評價
　　 1.2.1、各組動物手術(shù)評價
　　 常規(guī)記錄手術(shù)時間及成功率，觀察并嚴格記錄術(shù)后并發(fā)癥及恢復(fù)情況。兩組動物平均手術(shù)時間及術(shù)后恢復(fù)時間無明顯差異，手術(shù)成功率100％，其中手術(shù)組及假手術(shù)組各死亡2只，死亡率6.7％，死亡原因分別為術(shù)后腸梗阻及吻合口漏。該研究證明回腸轉(zhuǎn)位術(shù)與假手術(shù)相比，術(shù)式安全可靠。
　　 1.2.2、回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對動物進食、體重、空腹血糖、口

22、服糖耐量及胰島素抵抗的影響
　　 術(shù)后常規(guī)多個時間點記錄動物食物攝取量，體重及空腹血糖濃度并行口服糖耐量實驗和胰島素抵抗實驗。結(jié)果顯示，術(shù)后動物攝食量第4周與假手術(shù)組出現(xiàn)明顯差異，體重在第8周出現(xiàn)差異。而血糖及糖耐量、胰島素抵抗改善都早于攝食和體重的改變，提示手術(shù)對于葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改善作用可能不依賴于體重和攝食量的變化。同時，通過6個月的檢測，手術(shù)組血糖維持穩(wěn)定，有顯著改善，故回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對血糖的改善是長期（6個月）而穩(wěn)定的。

23、r>　　 1.2.3、回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對胰島β細胞功能影響
　　 胰島β細胞功能是指胰島β細胞在葡萄糖的刺激下，分泌胰島素以保持穩(wěn)定的機體血糖水平的功能。測定胰島β細胞功能手段之一是測量血清胰島素含量和C肽水平。為了證實回腸轉(zhuǎn)位術(shù)在胰島素β細胞功能改善的作用，收集大鼠空腹或者胃灌注葡萄糖后血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清中胰島素及C肽水平。結(jié)果證實，回腸轉(zhuǎn)位術(shù)能夠促進血清胰島素及C肽分泌，改善胰島β細胞功能。

24、　　 1.2.4、回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對胃腸激素分泌影響
　　 為了研究回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對胃腸激素分泌的影響，本研究測定大鼠血清樣本中GLP-1、PYY及GIP的含量。有研究證實，胃旁路手術(shù)后血清GLP-1、PYY持續(xù)性明顯增加，而在動物實驗中，GLP-1已經(jīng)被證實能促進胰島素分泌，增加胰島β細胞的增殖和抑制其凋亡。GLP-1通過直接與胰島β細胞的受體直接結(jié)合而起作用;另有人體實驗證據(jù)表明，減肥手術(shù)后GLP-1的升高能引起較長期的高胰島素低血

25、糖狀態(tài);而關(guān)于PYY的動物減肥手術(shù)研究也證實其可以促進胰島β細胞功能的增強。GIP又稱為葡萄糖依賴性胰島素釋放肽，是一個42個氨基酸的多肽，主要由十二指腸和空腸黏膜細胞分泌。在高血糖狀況下其可以促進胰島β細胞分泌胰島素，目前關(guān)于其在肥胖和2型糖尿病減肥手術(shù)的生理功能研究不足。通過對照研究，發(fā)現(xiàn)術(shù)后血清GLP-1，PYY明顯較假手術(shù)組升高，但是GIP的分泌區(qū)別不大，預(yù)示GIP可能不是減肥手術(shù)后血糖穩(wěn)定改善的因素之一。
　　 2.回

26、腸轉(zhuǎn)位術(shù)對動物心肌細胞葡萄糖攝取的影響
　　 葡萄糖攝取的作為血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要指標(biāo)。本研究采用術(shù)后離體新鮮大鼠心臟，灌注后胰島素刺激葡萄糖攝取，結(jié)果顯示術(shù)后短期葡萄糖攝取沒有明顯改善，而術(shù)后6個月對比手術(shù)組與假手術(shù)組，心肌細胞葡萄糖攝取功能明顯恢復(fù)。并且提示，回腸轉(zhuǎn)位術(shù)可能促進心肌胰島素信號及葡萄糖轉(zhuǎn)運功能。
　　 第三部分、回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代謝改善機制研究
　　 前期研究證明非肥胖2型糖尿

27、病大鼠心肌胰島素信號機葡萄糖轉(zhuǎn)運受損，而多篇文獻報道回腸轉(zhuǎn)位術(shù)在改善血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用，然而機制并未闡明。本研究第二部分研究發(fā)現(xiàn)回腸轉(zhuǎn)位術(shù)改善動物整體及心肌細胞的糖代謝，促進胰島β細胞功能改善及胃腸激素分泌，為了進一步闡明該手術(shù)對非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代謝改善的機制，本部分首先利用大鼠新鮮心臟及骨骼肌，采用Westernblot及免疫沉淀等分子生物學(xué)技術(shù)，對胰島素信號通路及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白進行研究。同時，本部分分離非肥胖2型糖尿病GK大

28、鼠心肌細胞進行培養(yǎng)，行體外實驗，并使用GLP-1及其受體激動劑Ex-4刺激培養(yǎng)細胞，探索GLP-1在心肌胰島素信號及葡萄糖轉(zhuǎn)運代謝中可能存在的作用機制，為藥物及手術(shù)治療糖尿病提供可能的思路及理論支持。
　　 1.回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對心肌胰島素信號的影響
　　 1.1、胰島素受體-β(IR-β)及其磷酸化蛋白表達增加
　　 術(shù)后6個月回腸轉(zhuǎn)位術(shù)組大鼠心臟IR-β明顯增加，并且磷酸化IR-β蛋白表達量與IR-β蛋白總量變化趨

29、勢相同，表明磷酸化蛋白增加可能與IR-β蛋白總量增加呈正相關(guān)，提示術(shù)后大鼠心肌胰島素信號存在改善。
　　 1.2、胰島素受體底物-1(IRS-1)及其磷酸化蛋白表達增加
　　 IRS-1及其磷酸化早在術(shù)后1個月即發(fā)生明顯變化，而術(shù)后6個月回腸轉(zhuǎn)位術(shù)手術(shù)組與假手術(shù)組中蛋白表達總量區(qū)別更明顯。
　　 1.3、胰島素刺激的IRS-1/PI3K蛋白信號通路改善
　　 IRS-1結(jié)合的PI3K活性增加被認為是胰島素

30、抵抗改善的重要指標(biāo)之一。我們采用免疫共沉淀法檢測IRS-1結(jié)合的PI3K活性表達，通過對比術(shù)后1個月及6個月IRS-1結(jié)合的PI3K蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1個月其表達量就有增加，而術(shù)后6個月IRS-1結(jié)合的PI3K增加更明顯，而術(shù)后1個月與6個月相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 2.回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對心肌及骨骼肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的影響
　　 本課題測定骨骼肌及心肌組織中GLUT4總蛋白及細胞膜含量的表達。所有分組總

31、GLUT4表達量未見明顯區(qū)別。術(shù)后1個月細胞膜蛋白GLUT4表達量增加，而6個月后增加量更加明顯。
　　 3.GLP-1及其受體激動劑在GK大鼠體外心肌細胞培養(yǎng)中胰島素樣作用
　　 通過離體心肌細胞培養(yǎng)以及對照研究實驗，我們發(fā)現(xiàn)GLP-1及其受體激動劑Ex-4都存在擬胰島素樣作用，其可以促進葡萄糖攝取及IRS-1結(jié)合的PI3K活性增加。本研究從而通過體外實驗，證明第二部分中回腸轉(zhuǎn)位術(shù)增加的血清GLP-1的分泌，而血清GL