骶韌帶成纖維細(xì)胞受力后細(xì)胞骨架系統(tǒng)變化的初步研究.pdf

1、目的:
　　 1、研究應(yīng)變量不同的兩種機(jī)械力對(duì)盆腔器官脫垂(pelvicorganprolapse，POP)患者與非POP患者骶韌帶成纖維細(xì)胞骨架形態(tài)的影響及骨架蛋白中β-actin、β-tubulin與vinculin表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 2、研究機(jī)械力與細(xì)胞骨架重塑的關(guān)系。
　　 3、從細(xì)胞骨架的變化探討機(jī)械力在女性盆腔器官脫垂(pelvicorganprolapse，POP)發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　

2、方法:
　　 1、研究對(duì)象:選取2011年10月-2012年9月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科接受手術(shù)治療的15例POP患者的骶韌帶為病例組;同期因子宮良性病變行子宮全切的15例非POP患者的骶韌帶作為對(duì)照組。兩組患者均無(wú)子宮內(nèi)膜異位癥、糖尿病及呼吸、消化、心血管系統(tǒng)等影響細(xì)胞骨架代謝的疾病，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用性激素治療。病例組與對(duì)照組在年齡、產(chǎn)次、孕次、體重指數(shù)等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、取材:經(jīng)河北醫(yī)科大

3、學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有患者簽署知情同意書。所取標(biāo)本為兩組患者近宮頸部分的骶韌帶組織，4℃冷盒送實(shí)驗(yàn)室，整個(gè)取材運(yùn)輸過程小于2小時(shí)并要求嚴(yán)格無(wú)菌。
　　 3、成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定:采用組織塊法進(jìn)行骶韌帶成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，通過倒置相差顯微鏡、HE染色及瑞姬染色進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫細(xì)胞熒光染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 4、細(xì)胞力學(xué)實(shí)驗(yàn):采用Flexcercell4000柔性基底拉伸加載系統(tǒng)，

4、分別對(duì)3～5代處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的對(duì)照組及病例組骶韌帶成纖維細(xì)胞加力，加載過程在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。加載參數(shù):幅度10％與20％，正弦波，0.5Hz，加載時(shí)間分別為:0、4、12、24小時(shí)。在設(shè)定的時(shí)間將病例組與對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)板取出立即進(jìn)行免疫熒光染色。在激光共聚焦顯微鏡及免疫熒光顯微鏡下觀察不同機(jī)械力對(duì)兩組骶韌帶成纖維細(xì)胞骨架中F-actin的影響，同時(shí)用免疫蛋白印跡技術(shù)測(cè)定受力前后骨架蛋白中β-actin、β-tubulin與vin

5、culin表達(dá)含量的變化。所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、所培養(yǎng)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則三角形，邊界清楚，約30天左右單層細(xì)胞達(dá)80％-90％匯合時(shí)呈放射狀或漩渦狀排列。免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫細(xì)胞熒光染色波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性，角蛋白和平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)陰性，結(jié)合取材部位證實(shí)為骶韌帶成纖維細(xì)胞。
　　 2、在機(jī)械力作用下骶韌帶成纖維細(xì)胞的形態(tài)及排列方式發(fā)生變

6、化，在10％應(yīng)變下隨著受力時(shí)間的延長(zhǎng)形態(tài)由原來(lái)的多形性成為單一的長(zhǎng)梭形，排列方向趨于規(guī)則并垂直于最大應(yīng)變方向，以24小時(shí)最明顯;20％應(yīng)變下部分細(xì)胞發(fā)生斷裂及明顯的皺縮，失去了原有的形態(tài)。
　　 3、在激光共聚焦顯微鏡及免疫熒光顯微鏡下可見FITC-phalloidin標(biāo)記的細(xì)胞骨架微絲呈綠色熒光，PI標(biāo)記的細(xì)胞核呈紅色熒光，未加力時(shí)兩組骶韌帶成纖維細(xì)胞熒光染色強(qiáng)，應(yīng)力纖維清晰可見;在10％應(yīng)變的作用下兩組骶韌帶成纖維細(xì)胞內(nèi)微絲

7、纖維排列方向隨加力時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)對(duì)力場(chǎng)順應(yīng)性的變化，但其熒光標(biāo)記強(qiáng)度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，4h時(shí)最弱，以后逐漸增強(qiáng)，于加力后24h熒光染色強(qiáng)度與靜態(tài)不加力組接近;在20％應(yīng)變作用下，隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞熒光強(qiáng)度持續(xù)減弱，于加力后24h可以清楚看到微絲結(jié)構(gòu)破壞，部分崩解成團(tuán)塊狀。此外，在不同應(yīng)力的不同階段，對(duì)照組細(xì)胞骨架微絲的熒光染色強(qiáng)度普遍較病例組要高。
　　 4、Westernblot凝膠電泳結(jié)果顯示在10％應(yīng)力作用下，對(duì)

8、照組及病例組骶韌帶成纖維細(xì)胞骨架蛋白中β-actin、β-tubulin的含量無(wú)明顯變化(P＞0.05)，而vinculin的表達(dá)水平隨加力時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高(P＜0.05);在20％應(yīng)力作用下，兩組骶韌帶成纖維細(xì)胞骨架蛋白中β-actin、β-tubulin及vinculin的表達(dá)水平均呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)（P＜0.05）。此外，在不同應(yīng)力的不同階段，對(duì)照組細(xì)胞骨架蛋白中β-actin、β-tubulin、vinculin的表達(dá)水平普遍

9、較病例組要高（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、應(yīng)變量不同的兩種機(jī)械力可以改變細(xì)胞的形態(tài)和伸展方向，分別對(duì)骶韌帶成纖維細(xì)胞骨架形態(tài)產(chǎn)生適應(yīng)或破壞性的作用效果，并影響著骨架蛋白中β-actin、β-tubulin與vinculin的表達(dá)含量。
　　 2、機(jī)械力作用下的細(xì)胞骨架重塑在POP的的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，非POP患者較POP患者具有更穩(wěn)定的細(xì)胞骨架系統(tǒng)。
　　 3、機(jī)械力在POP發(fā)病機(jī)制