損傷性腎勻漿體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)分化的實驗研究.pdf

1、目的：急性腎損傷是多種原因引起的以腎功能驟然下降為表現(xiàn)的臨床綜合征,目前尚無有效地針對病因的治療方法。急性腎損傷主要病理損害為急性腎小管壞死。因此，如何減輕腎小管的壞死、恢復(fù)腎小管的結(jié)構(gòu)和功能成為治療AKI的要點。骨髓間充質(zhì)干細胞具有多向分化的潛能，有研究報道外源性BMSCs可以歸巢至損傷腎臟并轉(zhuǎn)分化為腎小管上皮細胞，從而減輕腎臟結(jié)構(gòu)及功能的損傷。在體外研究中，利用急性腎損傷的微環(huán)境，也可以誘導(dǎo)BMSCs向腎小管上皮樣細胞分化。另外，還

2、有研究報道在BMSC修復(fù)損傷腎臟的過程中發(fā)現(xiàn)有多種細胞因子參與其過程，這也可能是其進行組織修復(fù)的機制之一。細胞角蛋白是上皮細胞的特異性標(biāo)記，腎小管上皮細胞優(yōu)先表達細胞角蛋白18型（CK-18）；在急性腎損傷時肝細胞生長因子（HGF）及其受體C-met表達增高，可以抑制細胞凋亡、減輕小管壞死、加速腎小管上皮細胞增殖，減輕腎小管損傷；骨形成蛋白（BMP-7）是一個重要的抑制纖維化的細胞因子，能夠拮抗TGF-β的促纖維化作用，調(diào)控炎癥因子表達

3、，維持腎小管上皮細胞表型，具有腎臟保護作用。本實驗擬通過大鼠缺血再灌注損傷性腎勻漿在體外模擬急性腎損傷的微環(huán)境，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞的轉(zhuǎn)分化，檢測誘導(dǎo)后細胞CK-18的表達；同時檢測腎臟保護相關(guān)因子HGF、BMP-7的表達，進而探討B(tài)MSCs對損傷腎臟修復(fù)的可能機制。
　　方法：體外分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，流式細胞儀對第三代細胞進行表面標(biāo)志物（CD73、CD105）的鑒定；取鑒定后的第三代BMSCs，分別用DMEM/F12培養(yǎng)液

4、+10％胎牛血清（對照組）；DMEM/F12培養(yǎng)液+10%胎牛血清+5μmol/L全反式維甲酸+10%大鼠缺血再灌注損傷腎臟組織勻漿上清液（誘導(dǎo)組）做體外細胞培養(yǎng)。7天后倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變、蛋白免疫印跡法檢測誘導(dǎo)后細胞角蛋白18(CK-18)的表達、實時熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)細胞內(nèi)肝細胞生長因子（HGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的mRNA的表達。
　　結(jié)果：成功分離、培養(yǎng)大鼠 BMSCs，流式細胞儀鑒定細胞表型

5、 CD73陽性率95.8%，CD105陽性率94.5%；經(jīng)缺血再灌注損傷大鼠腎臟勻漿誘導(dǎo)后7天，骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)由長梭形部分變?yōu)槎趟笮?、不?guī)則形；Western Blot檢測誘導(dǎo)后細胞CK-18的表達陽性，明顯高于對照組（P<0.05）；實時熒光定量PCR檢測HGF、BMP-7的mRNA表達誘導(dǎo)組明顯高于對照組（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴缺血再灌注損傷大鼠腎臟勻漿在體外可以誘導(dǎo)部分骨髓間充質(zhì)干細胞向腎小管上皮樣細胞轉(zhuǎn)分化，