口服減毒沙門氏菌傳遞shRNA表達(dá)載體在抗腫瘤治療中的應(yīng)用及前腦特異轉(zhuǎn)錄因子Fezf2對(duì)斑馬魚多種神經(jīng)元協(xié)調(diào)發(fā)育的調(diào)控.pdf

1、第一部分口服減毒沙門氏菌傳遞shRNA表達(dá)載體在抗腫瘤治療中的應(yīng)用
　　RNA干擾是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制，雙鏈RNA(dsRNA).經(jīng)剪切后通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)被定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)被抑制，即所謂的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。從RNA干擾機(jī)制被闡明至今，RNA干擾技術(shù)已成為一種普遍采用的基因組研究的實(shí)驗(yàn)工具，并被認(rèn)為是一種極有潛力的疾病治療手段。然而，盡管siRNA具備做為小分

2、子藥物的潛力，將siRNA引入臨床卻受到了siRNA的穩(wěn)定性和傳遞時(shí)的靶向性問(wèn)題的困擾。而表達(dá)shRNA的載體雖然能夠在體外培養(yǎng)的細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)介導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)間的RNA干擾，但表達(dá)載體的有效傳遞依然存在問(wèn)題。
　　隨著腫瘤治療學(xué)和細(xì)菌學(xué)研究的發(fā)展，減毒沙門氏菌載體系統(tǒng)作為治療惡性腫瘤的呈遞工具逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。通過(guò)口服或靜脈注射，沙門氏菌能夠有效地聚集到多種腫瘤中并抑制腫瘤生長(zhǎng)，甚至可以追蹤轉(zhuǎn)移的腫瘤；此外，沙門氏菌還能將攜帶的外源DN

3、A傳遞到腫瘤細(xì)胞中，發(fā)揮載體作用?？紤]到沙門氏菌特有的靶向腫瘤和傳遞外源功能性DNA的能力，我們首次嘗試了使用減毒沙門氏菌做為傳遞shRNA表達(dá)質(zhì)粒的載體，在腫瘤細(xì)胞中介導(dǎo)基于DNA載體的RNA干擾策略。研究選取了在90％以上惡性黑色素瘤中表達(dá)，并通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞高轉(zhuǎn)移能力的基因bcl2為靶標(biāo)基因，以減毒沙門氏菌為運(yùn)輸載體，經(jīng)口服將攜帶表達(dá)特異shRNA的質(zhì)粒載體導(dǎo)入荷瘤小鼠體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，減毒沙門氏菌能聚集在腫瘤中，并

4、將shRNA表達(dá)質(zhì)粒傳遞到腫瘤細(xì)胞，引起荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞中bcl2基因的表達(dá)水平顯著降低，瘤體生長(zhǎng)受到抑制(p<0.01)，小鼠壽命顯著延長(zhǎng)(p<0.05)。使用減毒沙門氏菌運(yùn)輸shRNA表達(dá)載體，在腫瘤細(xì)胞中誘發(fā)RNA干擾，特異性地沉默腫瘤發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵基因，這一方法有效解決了shRNA表達(dá)質(zhì)粒的腫瘤靶向性問(wèn)題，同時(shí)利用減毒沙門氏菌的抗腫瘤效應(yīng)，將兩種強(qiáng)有力的腫瘤治療手段結(jié)合起來(lái)，為提高癌癥治療方法的實(shí)用性和有效性進(jìn)行了有益的探索。

5、
　　第二部分前腦特異轉(zhuǎn)錄因子Fezf2對(duì)斑馬魚多種神經(jīng)元協(xié)調(diào)發(fā)育的調(diào)控
　　脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)是生命體最為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)之一，神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和機(jī)能單位是神經(jīng)細(xì)胞(又稱為神經(jīng)元)。神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)千差萬(wàn)別、數(shù)量定位也各不相同，并能合成分泌不同的神經(jīng)遞質(zhì)、建立不同的連接模式。在發(fā)育過(guò)程中，不同的神經(jīng)元是由共同的前體細(xì)胞產(chǎn)生的，我們對(duì)于調(diào)控前體細(xì)胞分化成不同類型神經(jīng)元的機(jī)制所知極少。本課題選取了斑馬魚問(wèn)腦神經(jīng)發(fā)育為研究對(duì)象，探究了

6、調(diào)控神經(jīng)分化的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)化中保守的前腦特異鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子Fezf2(又稱為Fezl)能夠調(diào)控問(wèn)腦結(jié)節(jié)后和下丘腦區(qū)域(PT/H區(qū)域)多種神經(jīng)元協(xié)調(diào)產(chǎn)生。Fezf2功能喪失不僅影響PT/H區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元和催產(chǎn)素能神經(jīng)元的發(fā)育，也會(huì)導(dǎo)致該區(qū)域GABA神經(jīng)元和其它一些Islet1陽(yáng)性中間神經(jīng)元的缺失；在早期神經(jīng)元發(fā)育受損的同時(shí)，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞標(biāo)志之一Olig2的表達(dá)卻增加了。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，受Fezf2

7、影響的PT/H區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元和GABA神經(jīng)元在發(fā)育的相同階段產(chǎn)生。與不同神經(jīng)前體細(xì)胞分化和不同神經(jīng)元命運(yùn)相關(guān)的proneural基因neurogenin1和ascl1a以及在多巴胺能神經(jīng)元中表達(dá)的otpb和在分化中的GABA神經(jīng)元中表達(dá)的dlx2都是Fezf2作用的下游因子，表明Fezf2通過(guò)在發(fā)育早期建立表達(dá)不同proneural基因的神經(jīng)前體細(xì)胞群體來(lái)協(xié)調(diào)不同類型神經(jīng)元的發(fā)育，同時(shí)也能調(diào)控在特異神經(jīng)元中表達(dá)的

8、決定因子，在發(fā)育的不同階段調(diào)控了神經(jīng)細(xì)胞的命運(yùn)。Fezf2激活前體細(xì)胞中proneural基因的表達(dá)能夠活化相鄰細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路，而活化了的Notch信號(hào)通路則抑制fezf2的表達(dá)。由此可見(jiàn)，前腦特異的轉(zhuǎn)錄因子Fezf2能夠調(diào)控多種神經(jīng)元的協(xié)調(diào)發(fā)育并受到Notch信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)控。事實(shí)上，存在于特定區(qū)域前體細(xì)胞中的調(diào)控因子(如前腦中的Fezf2)與Notch信號(hào)通路間的相互調(diào)控可能是在器官發(fā)育過(guò)程中協(xié)調(diào)不同類型細(xì)胞有序產(chǎn)生