AGEs對(duì)缺氧條件下心肌內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力的影響及ERK5在其中的作用.pdf

1、研究背景及實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　糖尿病患者冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病者提高了2-4倍,2/3的糖尿病患者死于冠心病。糖尿病狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)的高血糖、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種病理因素促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,導(dǎo)致冠脈管腔狹窄或阻塞,最終引起心臟的缺血缺氧。作為機(jī)體的代償性反應(yīng),缺氧條件下,血管內(nèi)皮細(xì)胞通過分裂、增殖、遷移等過程形成新生血管開放側(cè)支循環(huán)以增加缺血區(qū)的血液供應(yīng),這對(duì)于維持心肌細(xì)胞功能、減少心力衰竭、心源性猝死等并

2、發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。然而,動(dòng)物和臨床研究均表明,糖尿病或持續(xù)高血糖狀態(tài)明顯抑制心肌缺血后新生血管的形成和側(cè)支循環(huán)的建立,但具體機(jī)制不明。我們認(rèn)為可能與糖尿病抑制缺血缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力有關(guān)。
　　晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)是機(jī)體在持續(xù)高血糖狀態(tài)下,由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸經(jīng)過非酶促的糖基化以及多步的氧化、脫水和分子重排而形生穩(wěn)定的、不可逆的大分子復(fù)合物。

3、AGEs的形成可引起體內(nèi)多種酶的失活進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變,AGEs與其受體的結(jié)合還可以激活信號(hào)通路產(chǎn)生多種病理反應(yīng)。糖尿病患者血清及組織中的AGEs水平明顯升高。臨床研究表明,AGEs的水平與糖尿病大血管和微血管發(fā)生病變的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān),是糖尿病血管病變的重要致病因素。
　　細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(Extracellular signal regulated kinase 5,ERK5)是絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)家族成員之

4、一,可被多種胞外刺激(如低氧、高滲溶液、血流剪切力等)所激活發(fā)生磷酸化。有研究證實(shí)ERK5可對(duì)VEGF起到一定調(diào)控作用。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究AGEs對(duì)缺氧狀態(tài)下心肌內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力的影響,并以ERK5為切入點(diǎn)探討其可能機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:心肌內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及AGEs的制備、含量測(cè)定
　　1.采用蛋白酶消化法分離培養(yǎng)SD雄性大鼠心肌內(nèi)皮細(xì)胞,根據(jù)組織來源和形態(tài)學(xué)的特殊性、是否表達(dá)Ⅷ因子以及吞

5、噬乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AC-LDL)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　2.5gBSA、9gD-葡萄糖及10mg青、鏈霉素溶于100mlPBS中,無菌過濾后分裝,置于37℃孵箱中避光孵育90d,孵育結(jié)束后采用熒光分光光度法鑒定AGEs并計(jì)算其含量。
　　實(shí)驗(yàn)二:AGEs對(duì)缺氧條件下心肌內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力的影響
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:
　　對(duì)照組:培養(yǎng)液,95％;AGEs組:AGEs400mg/L,95%;缺氧組:培養(yǎng)液,5

6、%;AGEs+缺氧組:AGEs400mg/L95%,5%。
　　2.檢測(cè)指標(biāo):
　　MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖、Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力、Matrigel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)管樣結(jié)構(gòu)形成能力、ELISA檢測(cè)細(xì)胞VEGF分泌量。
　　實(shí)驗(yàn)三:AGEs對(duì)缺氧條件下心肌內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力影響的機(jī)制研究
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:
　　缺氧組:培養(yǎng)液,5%;AGEs+缺氧組:AGEs400mg/L,5%;ERK5抑制劑組:

7、AGEs400mg/L,XMD8-925μmol/L,5%。
　　2.檢測(cè)指標(biāo):
　　Western blot法檢測(cè)ERK5的表達(dá)及ERK5的磷酸化水平,其余檢測(cè)指標(biāo)同實(shí)驗(yàn)二。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:心肌內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及AGEs的制備、含量測(cè)定
　　1.酶消化法培養(yǎng)所得心肌內(nèi)皮細(xì)胞:培養(yǎng)至3d時(shí)多數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈梭形或多角形,部分細(xì)胞連接成片,折光性好;7d時(shí)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底,形態(tài)學(xué)觀察呈典型鋪

8、路石樣生長(zhǎng),鋪滿培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。培養(yǎng)所得細(xì)胞的Ⅷ因子陽性率為92%,95%細(xì)胞可吞噬DiL-ac-LDL。
　　2.熒光分光光度計(jì)鑒定,所制備AGEs含量為94.7kU/g。
　　實(shí)驗(yàn)二:AGEs對(duì)缺氧條件下心肌內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力的影響
　　1.與對(duì)照組比較,缺氧組細(xì)胞的增殖、遷移、管樣結(jié)構(gòu)形成能力及VEGF分泌量有所增加(P<0.05)。
　　2.與缺氧組比較,AGEs+缺氧組細(xì)胞的增殖、遷

9、移、管樣結(jié)構(gòu)形成能力及VEGF分泌量顯著降低(P<0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)三:AGEs對(duì)缺氧條件下心肌內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力影響的機(jī)制研究
　　1.與缺氧組比較,AGEs+缺氧組ERK5磷酸化水平顯著增加,XMD8-92可顯著抑制ERK5的磷酸化(P<0.05)。
　　2.與AGEs+缺氧組比較,抑制劑組細(xì)胞的增殖、遷移、管樣結(jié)構(gòu)形成能力及VEGF分泌均有所增加(P<0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.AGE