馬索羅酚和丹參酮ⅡA對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠治療作用的病理學研究.pdf

1、目的:中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘疾病是部位發(fā)生在腦和脊髓，主要特征是髓鞘損傷，而神經元胞體和軸索損害相對較輕的一組疾病。多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是由免疫介導的中樞神經系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘性疾病，病因及發(fā)病機制迄今不明，最新研究表明，MS的病因與遺傳因素和環(huán)境因素有關，而疾病導致的髓鞘脫失和軸索變性是患者表現為神經功能缺損，病程呈現為緩解-復發(fā)和病情持續(xù)進展的主要原因。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimenta

2、l autoimmune encephalomyelitis，EAE)是MS經典的動物模型，其病程上可以表現為復發(fā)-緩解，很接近于人類MS的臨床表現及病理特征。本研究應用MOG35-55建立EAE動物模型，在EAE小鼠出現神經癥狀后開始給予馬索羅酚和丹參酮ⅡA治療，模擬臨床的治療時間，通過HE染色觀察兩種藥物對EAE動物模型是否有抗炎作用，通過羅克沙爾堅牢藍(Luxol Fast Blue)特殊髓鞘染色和Bielschowsky's神經

3、軸索染色從病理學和形態(tài)學的角度觀察馬索羅酚和丹參酮ⅡA是否能夠減輕CNS髓鞘的脫失，減輕軸索病理損傷，降低EAE小鼠的神經功能評分。
　　方法:本研究采用了45只8-12周齡，健康C57BL/6雌性小鼠，小鼠隨機分成三組即EAE組、NDGA組和DANⅡA組，以MOG35-55為抗原免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型。用生理鹽水將抗原MOG35-55稀釋成為5mg/ml的液體狀態(tài)，然后將完全弗氏佐劑（其中包含的結核桿菌H37Ra的

4、終濃度為4mg/ml）按1∶1的體積加入并混合均勻，乳化后按每只0.1ml在小鼠脊柱兩側的皮膚下分四點注射，免疫后的當天即第0h及第48h腹腔內注射500ngPTX（1000ng/只）。小鼠發(fā)病后，自神經功能評分達到1分以上時開始給予藥物治療，即EAE組小鼠腹腔注射5％DMSO，NDGA組小鼠腹腔注射馬索羅酚，DANⅡA組小鼠腹腔注射丹參酮，分別于治療前，治療10d，治療20d取材，每組各取5只。取材部位為小鼠脊髓腰膨大處，組織進行石蠟

5、包埋，分別通過HE染色觀察病變部位炎性反應程度和血管套形成的情況，羅克沙爾堅牢藍(Luxol Fast Blue)特殊髓鞘染色和Bielschowsky's神經軸索染色從病理學及形態(tài)學的角度觀察馬索羅酚和丹參酮ⅡA兩種藥物能否可以減輕小鼠病變部位的髓鞘脫失，減輕組織的軸索損傷，降低EAE小鼠的神經功能評分起到治療作用。應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，結果為計量資料則均數±標準差（(x)±S）表示，而多組計量資料均數的比較則采

6、用ANOVA方差分析，若不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用秩和檢驗的方法，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1動物臨床癥狀及評分觀察:
　　1.1臨床癥狀:
　　45只小鼠全部在10-16d內開始發(fā)病，表明EAE動物模型制作成功，可以給予藥物干預治療，EAE組小鼠免疫后全部發(fā)病，出現皮毛粗糙、精神萎靡不振、行走困難、喪失食欲、體重減輕等表現。臨床表現最嚴重在發(fā)病高峰期，小鼠出現雙后肢甚至全部四肢肌

7、力降低甚至全部癱瘓、大便、小便均失禁、不能夠自主翻身，個別成垂死狀態(tài)，并且持續(xù)較長時間。治療組的小鼠免疫后也全部發(fā)病，于癥狀評分達到1分以上時給予藥物干預，治療前與EAE組臨床癥狀評分無顯著差異，治療10天后，此時EAE處于發(fā)病高峰期，臨床表現嚴重，而給予丹參酮及馬索羅酚治療的小鼠出現尾部癱瘓或者雙后肢輕癱或全癱，無大小便失禁及不能自主翻身等癥狀，治療20天后，EAE小鼠隨著病程發(fā)展，癥狀有所緩解，但仍遺留尾部癱瘓或后肢癱瘓等癥狀，給予

8、丹參酮及馬索羅酚治療的小鼠癥狀緩解較快，臨床癥狀表現更輕，僅表現為尾部輕癱或者尾部無力等癥狀。
　　1.2臨床評分觀察:
　　計算并比較各組中每只小鼠于治療10d及治療20d的臨床評分均數。EAE組小鼠神經功能評分高于丹參酮組及馬索羅酚組(P＜0.05)。丹參酮組及馬索羅酚組小鼠神經功能評分相比較，差別沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2 HE染色:
　　2.1治療前三組可見散在炎性細胞浸潤，大部分集中在脊髓

9、白質附近。
　　2.2治療10天 EAE組可見大片狀炎性細胞的浸潤，甚至形成了“血管袖套”現象，即脊髓多處小血管周圍，特別是小靜脈四周出現了炎癥細胞，大部分為淋巴細胞，病變大多在前角白質，灰白質交界及前正中裂血管周圍，丹參酮組及馬索羅酚組“血管袖套”形成較少，炎性細胞主要集中于小血管周圍，三組HE病理評分有統(tǒng)計學差異。
　　2.3治療20天 EAE組炎性細胞和“血管袖套”減少，丹參酮組及馬索羅酚組炎性細胞更少，“血管袖套”消

10、失，三組HE病理評分有統(tǒng)計學差異。
　　3 LFB染色:
　　三組小鼠在治療前，髓鞘并無明顯的脫失部位，但仍能觀察到脊髓白質內部分髓鞘變薄，顏色變淺。EAE組在發(fā)病高峰期可觀察到脊髓內存在大小不等的片狀脫髓鞘區(qū)域，病變大多表現在前后角周圍內的白質，藍色髓鞘部位減少，顏色變淡，甚至出現了大片狀氣球樣空泡變性的髓鞘脫失區(qū)域，髓鞘脫失部位常伴隨著大片炎癥細胞浸潤，表明髓鞘脫失和炎癥浸潤有一定關系，在治療20d后較高峰期脫髓鞘區(qū)域內

11、病變無明顯改變;而丹參酮組及馬索羅酚組在治療10d后可見部分髓鞘變薄，顏色變淺，存在一些小的髓鞘脫失區(qū)，但沒有形成大片狀髓鞘脫失區(qū)域，病灶散在成點灶狀，治療20d較治療前及治療10d髓鞘變粗，藍色髓鞘區(qū)域有所增加，三組髓鞘病理評分在治療10d及治療20d均具有統(tǒng)計學差異。
　　4.Bielschowsky's神經軸索染色:
　　4.1治療前:三組小鼠均已存在軸索損傷，損傷的軸索表現為形狀不規(guī)則、排列紊亂、腫脹扭曲。
　

12、　4.2治療10天: EAE組處于發(fā)病高峰期，軸索損傷更為明顯，病灶成大片狀，形態(tài)更加不規(guī)則，直徑大小不一，軸索斷裂，斷端形成卵圓小體，甚至出現軸索的消失，部位與炎性細胞浸潤及髓鞘的脫失具有一致性，并且與疾病的嚴重程度相關，丹參酮組及馬索羅酚組軸索也存在損失，但范圍及程度與EAE組相比較輕。
　　4.3治療20天:EAE組在治療20d后與治療10天相比，無明顯變化，丹參酮組及馬索羅酚組損傷較治療前及治療10d較輕。
　　結論