探討巨噬細(xì)胞TREM-1通路和淋巴細(xì)胞Tim-3通路在膿毒血癥發(fā)病中的作用機制.pdf

1、本文內(nèi)容分為三部分進(jìn)行介紹：
　　第一部分 TREM-1通路在膿毒血癥中的表達(dá)及機制研究
　　目的：研究 TREM-1分子在膿毒血癥各類炎性細(xì)胞上的表達(dá)及TREM-1通路在膿毒血癥發(fā)病中的作用機制。
　　方法：構(gòu)建 BALB/c小鼠腹腔膿毒血癥模型,收獲腹腔細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測TREM-1分子在各類炎性細(xì)胞上的表達(dá);分離正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,加入銅綠假單胞菌共培養(yǎng),在培養(yǎng)液中加入 TREM-1融合蛋白封閉 TREM

2、1/DAP12通路,應(yīng)用瑞氏染色技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬能力變化,應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞分泌炎性因子水平變化,應(yīng)用實時定量 PCR技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子表達(dá)水平;構(gòu)建BALB/c小鼠腹腔膿毒血癥模型,使用TREM-1融合蛋白及對照 IgG進(jìn)行治療,對膿毒血癥小鼠生存時間進(jìn)行統(tǒng)計;構(gòu)建 BALB/c小鼠腹腔膿毒血癥模型,使用TREM-1融合蛋白及對照 IgG進(jìn)行治療,24小時后處死小鼠,收獲外周血用于分析血清中IL-1、TN

3、F-α、MCP-1等炎性因子水平變化,收獲腹腔細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測 CD40、CD86等協(xié)同刺激分子在巨噬細(xì)胞上的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：TREM-1分子大量表達(dá)于小鼠中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上,而在淋巴細(xì)胞上不表達(dá),且在銅綠假單胞菌急性感染引起的膿毒血癥模型中,TREM-1分子在巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞上的表達(dá)明顯增高;使用TREM-1融合蛋白阻斷該通路后顯著延長膿毒血癥小鼠死亡時間;使用TREM-1融合蛋白阻斷該通路后在體內(nèi)外均能顯著

4、降低巨噬細(xì)胞分泌 IL-1、TNF-α、MCP-1等炎性因子能力,但對巨噬細(xì)胞吞噬功能無顯著影響;使用TREM-1融合蛋白阻斷該通路后在體內(nèi)外均能顯著降低其表面 CD40、CD86等協(xié)同刺激分子表達(dá),從而影響巨噬細(xì)胞抗原提呈功能。
　　結(jié)論：TREM-1通路表達(dá)于膿毒血癥相關(guān)巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞,阻斷該通路可以顯著減少巨噬細(xì)胞釋放 IL-1、TNF-α等炎性因子能力,且顯著降低巨噬細(xì)胞活化、抗原提呈功能,從而顯著降低膿毒血癥發(fā)生時

5、過度放大的炎性反應(yīng),最終明顯延長膿毒血癥小鼠存活。
　　第二部分研究Tim-3信號通路和Th17細(xì)胞的相關(guān)性以及在肺炎克雷伯菌感染引起的肺炎中的作用
　　目的：研究 Tim-3信號通路和Th17細(xì)胞的關(guān)系以及在急性肺炎發(fā)病時的作用機制。
　　方法：分離正常小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,加入特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo) T細(xì)胞向 Th17細(xì)胞分化,一段時間后檢測 Th17細(xì)胞上 Tim-3分子表達(dá)水平,且加入 Galectin-9激活 Tim

6、-3通路后檢測 Th17細(xì)胞凋亡變化;建立 BALB/c小鼠肺炎克雷伯菌急性肺炎感染模型,使用Galectin-9或?qū)φ?PBS治療急性肺炎小鼠,記錄各組小鼠存活時間;建立 BALB/c小鼠肺炎克雷伯菌急性肺炎感染模型,使用Galectin-9或?qū)φ?PBS治療急性肺炎小鼠,不同時間點處死小鼠并收獲外周血血清檢測 IL-17、IFN-γ、IL-4、G-CSF、MIP-2等細(xì)胞因子水平,同時檢測脾臟 CD4+及CD8+T細(xì)胞絕對值、外周血

7、中性粒細(xì)胞絕對值、肺組織內(nèi)細(xì)菌含量等指標(biāo)變化。
　　結(jié)果：脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng) CD3抗體、CD28抗體、TGF-β、IL-6誘導(dǎo)后明顯向 Th17細(xì)胞分化,且流式檢測結(jié)果顯示 Tim-3分子在誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞上大量表達(dá),達(dá)到65％;經(jīng)誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞加入 Galectin-9激活 Tim-3通路后可以引起 Th17細(xì)胞凋亡增加,從而顯著降低 IL-17分泌;體內(nèi)使用Galectin-9融合蛋白治療肺炎克雷伯菌感染引起的急性肺炎可以

8、加速小鼠死亡,原因可能為使用Galectin-9激活 Tim-3通路后減少IL-17與 IFN-γ水平,從而顯著降低 G-CSF和MIP-2分泌。G-CSF和MIP-2分泌減少造成中性粒細(xì)胞增殖過少,不足以對抗體內(nèi)的肺炎克雷伯菌,從而造成大量細(xì)菌在肺組織內(nèi)繁殖,加速肺炎小鼠死亡。
　　結(jié)論：Tim-3分子在 Th17細(xì)胞上表達(dá)且激活 Tim-3通路同樣引起 Th17細(xì)胞凋亡。使用Galectin-9激活該通路后可以顯著降低體內(nèi)外

9、IL-17水平,間接引起中性粒細(xì)胞增殖減少,導(dǎo)致大量細(xì)菌在組織內(nèi)繁殖,從而加速肺炎小鼠的死亡。
　　第三部分 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及DC細(xì)胞通過Tim-3信號通路調(diào)節(jié)膿毒血癥小鼠存活
　　目的：研究 Tim-3分子在膿毒血癥各類炎性細(xì)胞上的表達(dá)及Tim-3通路調(diào)節(jié)膿毒血癥的作用機制。
　　方法：構(gòu)建銅綠假單胞菌腹腔感染引起的BALB/c小鼠膿毒血癥模型,收獲小鼠腹腔總細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測 Tim-3分子在

10、各類炎性細(xì)胞上的表達(dá);構(gòu)建銅綠假單胞菌腹腔感染引起的BALB/c小鼠膿毒血癥模型,給予 Tim-3封閉蛋白或?qū)φ?IgG進(jìn)行治療,觀察各組小鼠存活時間,并定期處死小鼠收獲血清檢測 IL-1、TNF-α、IFN-γ、IL-4等炎性因子變化;體外分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,加入 LPS進(jìn)行誘導(dǎo),加入 Tim-3封閉蛋白阻斷該通路,48小時后檢測各類炎性因子分泌變化,檢測阻斷該通路后淋巴細(xì)胞增殖、凋亡等功能變化;構(gòu)建小鼠膿毒血癥模型,給予 Tim-

11、3封閉蛋白或?qū)φ?IgG進(jìn)行治療,檢測外周血及腹腔炎性細(xì)胞數(shù)量及銅綠假單胞菌細(xì)菌含量,體內(nèi)檢測淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞增殖、活化改變,檢測巨噬細(xì)胞吞噬、凋亡改變。
　　結(jié)果：Tim-3分子在膿毒血癥腹腔 CD4+T細(xì)胞、 CD8+T細(xì)胞、CD11c+DC細(xì)胞上表達(dá),而在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上不表達(dá),且膿毒血癥時 Tim-3分子在腹腔 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD11c+DC細(xì)胞上和正常小鼠相比,表達(dá)顯著增高,分別達(dá)到28％、38

12、％及23％;使用Tim-3封閉蛋白阻斷該通路后可以顯著降低 IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎性因子分泌,從而顯著延長膿毒血癥小鼠存活;體外使用Tim-3封閉蛋白阻斷該通路引起淋巴細(xì)胞增殖與活化減少、但凋亡增加;體內(nèi)使用Tim-3封閉蛋白治療膿毒血癥小鼠同樣減少 T淋巴細(xì)胞與 DC細(xì)胞活化;體內(nèi)使用Tim-3封閉蛋白治療膿毒血癥小鼠對巨噬細(xì)胞吞噬功能無影響,但可以增加趨化至腹腔的巨噬細(xì)胞絕對值,減少腹腔細(xì)菌含量,同時體內(nèi)阻斷該通路可以