中國漢族CHC患者病程及對規(guī)范化治療反應(yīng)性與KIR2DL2基因相關(guān)性的群體分析.pdf

1、目的：
　　1、通過觀察中國漢族人群中CHC患者和健康人之間KIR基因、HLA-C基因的頻率變化,深入探討中國漢族人群中KIR基因、HLA-C基因與CHC病程的相關(guān)性;
　　2、通過觀察中國漢族人群中CHC患者經(jīng)規(guī)范化治療后不同反應(yīng)者的KIR基因、HLA-C基因的頻率變化,尋找對CHC治療反應(yīng)有影響力的基因;
　　3、經(jīng)薈萃分析(Meta-analysis)對pubmed上多個(gè)CHC治療效果研究資料進(jìn)行分析和概括,并結(jié)

2、合本次研究結(jié)果對KIR2DL2對CHC治療反應(yīng)的影響;
　　4、通過調(diào)節(jié)KIR2DL2基因的表達(dá),觀察其對NK細(xì)胞功能影響的特點(diǎn),分析KIR2DL2影響CHC治療反應(yīng)的可能機(jī)制,為CHC治療以及預(yù)后判斷提供可能途徑和新的治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.入選中國漢族人群中CHC病例通過生化指標(biāo)檢測ALT,ELISA檢測HCV抗體,Realtime-PCR定量檢測HCVRNA。ELISA檢測排除入選病例HAV、HBV、HD

3、V、HEV、HIV病毒感染。
　　2.通過飽和鹽析的方法從研究對象的抗凝血中提取DNA,采用序列特異性引物擴(kuò)增技術(shù)(PCR—Sequence Specific Primer,PCR-SSP)對樣本進(jìn)行KIR和HLA-C分型,讀取結(jié)果后計(jì)算基因頻率,并統(tǒng)計(jì)分析比較中國漢族人群CHC患者和健康對照者之間的差異。
　　3.中國漢族人群中CHC患者接受規(guī)范化治療,即聚乙二醇干擾素-α(1.5微克/公斤體重/周)和利巴韋林(0.9g/

4、天)。所有患者進(jìn)行至少6個(gè)月治療后按照與以前報(bào)道的病毒學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分為兩個(gè)治療結(jié)果:持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological responders,SVR)和無應(yīng)答(nonresponders,NR),提取研究對象DNA,采用PCR-SSP對樣本進(jìn)行KIR和HLA-C分型,統(tǒng)計(jì)分析比較SVR和NR之間的差異。
　　4.引入配對分析方法,將KIR2DL1與HLA-C2、KIR2DL2與HLA-C1配對,統(tǒng)計(jì)配對頻率,比較

5、中國漢族人群CHC患者和健康對照者之間、SVR和NR之間的差異。
　　5.在pubmed數(shù)據(jù)庫(1995.11-2013.4)中,以“KIR2DL2”和“HCV”為關(guān)鍵詞搜索文獻(xiàn),并按照需要英文書寫、與國際標(biāo)準(zhǔn)相同的CHC診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方法及結(jié)果判斷、PCR-SSP檢測KIR基因并含有KIR2DL2頻率數(shù)據(jù),患者除HCV感染外無其他疾病等篩選條件,選出合適的文獻(xiàn)用于Meta分析,確定文獻(xiàn)異質(zhì)性、發(fā)表偏倚,選擇固定效應(yīng)模型計(jì)算總體風(fēng)

6、險(xiǎn)系數(shù)。
　　6.使用經(jīng)5-Aza-dc處理后的NK92細(xì)胞,該細(xì)胞表面可高表達(dá)KIR2DL2分子,觀察不同抗體濃度抗體封閉KIR2DL2受體后,NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性。
　　7.SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.基因分型結(jié)果表明:KIR2DL2、KIR2DS3計(jì)算的OR值均大于1,提示在CHC患者中這兩種基因的頻率高于健康對照組,這可能是CHC發(fā)生的危險(xiǎn)因素;同時(shí),HLA-Cw

7、*06,HLA-Cw*15,KIR2DS4計(jì)算的OR值小于1,提示在CHC患者中這些基因的頻率低于健康對照組,這些基因的存在可能可以抑制CHC的發(fā)生。
　　2.在SVR與NR患者的分型結(jié)果中,我們可以看到KIR2DL2和HLA-Cw*03計(jì)算的OR值仍然大于1,提示在治療效果較差的CHC患者(NR)中KIR2DL2基因的頻率高于SVR組,攜帶有該基因的CHC患者的治療反應(yīng)要弱。
　　3.KIR/HLA-C配對分析顯示,KIR

8、2DL2+HLA-Cgroup1配對OR值大于1,同時(shí)該組合在NR患者中的頻率要高于SVR,提示在CHC中這種組合的存在可能有利于CHC的發(fā)生以及不利于CHC的治療;KIR2DL1+HLA-Cgroup2配對OR值小于1,提示這種組合的存在可能對抑制CHC的發(fā)生有一定作用。
　　4.Meta分析結(jié)果同樣提示KIR2DL2對CHC治療的負(fù)面影響。
　　5.經(jīng)5-Aza-dc處理后的NK92細(xì)胞,該細(xì)胞表面可高表達(dá)KIR2DL2

9、分子,在使用抗體濃度20μg/ml封閉KIR2DL2受體后,NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1.KIR2DL2可以抑制NK細(xì)胞活性;
　　2.KIR2DL2和它的受體HLA-Cgroup1可能有利于中國漢族人群中CHC的發(fā)生以及對PeglFN-α與利巴韋林聯(lián)合治療的反應(yīng)不佳;
　　3.KIR2DS3在中國漢族人群CHC患者中的頻率高于健康對照組,這可能是中國漢族人群中CHC發(fā)生的危險(xiǎn)因

10、素;
　　4.HLA-Cw*06,HLA-Cw*15,KIR2DS4CHC患者中的頻率低于健康對照組,這些基因的存在可能可以抑制CHC的發(fā)生。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.目前,在高加索人群中有關(guān)于KIR與CHC相關(guān)性的報(bào)道,但在中國漢族人群中未見相關(guān)報(bào)道,本研究主要通過PCR-SSP檢測中國漢族人群CHC患者中KIR頻率與疾病以及治療的相關(guān)性。
　　2.通過研究結(jié)果及Meta分析,首次提出在中國漢族人群中KI

11、R2DL2為CHC發(fā)生以及治療的負(fù)面因子。
　　本研究的意義：
　　1.通過研究,發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中KIR2DL2的存在具有較強(qiáng)的NK細(xì)胞抑制能力,使得KIR2DL2的存在可能不利于HCV的清除,導(dǎo)致HCV感染規(guī)范化治療效果差,進(jìn)而有利于HCV持續(xù)性感染發(fā)生。
　　2.KIR2DL2可成為一種HCV治療效果預(yù)判指標(biāo),也是中國漢族人群中CHC發(fā)生流行病學(xué)危險(xiǎn)因素,在后期研究中,KIR2DL2可成為免疫治療CHC的重要靶