免培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)下的放線菌分離方法研究.pdf

1、應(yīng)用變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)、磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid，PLFA)分析和BIOLOG ECO微培養(yǎng)等免培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)不同生境的土壤樣品以及經(jīng)過(guò)不同方法處理的土壤樣品進(jìn)行了微生物多樣性探測(cè)，在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)放線菌分離培養(yǎng)基、選擇適宜的分離方法，開(kāi)展放線菌的分離和識(shí)別工作。
　　 DGGE結(jié)果提示樣品453和219中蘊(yùn)

2、含著大量新分類單元的放線菌資源;PLFA顯示土樣干熱處理、添加適量抑制劑是抑制土壤真菌和革蘭氏陰性菌的有效手段、選擇性富集培養(yǎng)是提高革蘭氏陽(yáng)性菌比例的有效手段;BIOLOG ECO微培養(yǎng)技術(shù)揭示微生物對(duì)不同類碳源具有選擇性利用傾向，革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)脂類碳源具有利用傾向。
　　 以免培養(yǎng)研究結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了以單糖、二糖及多糖、氨基酸、脂類為碳源的22種單一碳源分離培養(yǎng)基和以復(fù)雜或混合營(yíng)養(yǎng)底物為碳源的10種復(fù)合碳源培養(yǎng)基，運(yùn)用干熱處

3、理、添加抑制劑和富集培養(yǎng)協(xié)同處理的方法，通過(guò)稀釋涂布平板法從204份土壤樣品中分離、純化得到菌株1905株。經(jīng)過(guò)觀察初步排除形態(tài)重復(fù)菌株后選擇406株菌測(cè)定了16S rRNA部分基因序列，結(jié)果顯示其中有367株放線菌，39株細(xì)菌。放線菌隸屬于以下35個(gè)屬:Streptomyces、Nonomuraea、Actinomadura、Nocardia、Actinopolymorpha、Polymorphospora、Micromonospor

4、a、Microbispora、Microtetraspora、Catellatospora、Nocardioides、Nocardiopsis、Rhodococcus、Saccharothrix、Amycolatopsis、Isoptericola、Arthrobacter、Actinoplanes、Oerskovia、Herbidospora、phaerisporangium、Dactylosporangiu、Streptospora

5、ngium、Kribbella、Pseudonocardia、Cryptosporangium、 Dietzia、 Actinoallomurus、Mycobacterium、Planotetraspora、phingomonas、Couchioplanes、Verrucosispora、Plantactinospora、Promicromonospora;細(xì)菌隸屬于以下15個(gè)屬:Staphylococcus、Viridibacillu

6、s、Vario vorax、Brevibacillus、Bacillus、Cellulosimicrobiumt、Steroidobacter、Belnapia、Chryseobacterium、Methylobacterium、Halomonas、Marinococcus、Jeotgalibacillus、Micrococcus、Planomicrobium。其中Streptomyces占45.1％，Micromonospora占7.

7、4％，其它稀有放線菌共34個(gè)屬，占47.5％。77株放線菌和8株細(xì)菌為潛在新微生物分類單元菌株。
　　 應(yīng)用多相分類手段（包括形態(tài)特征觀察、生理生化特性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞化學(xué)組分分析、DNA G+C含量測(cè)定、DNA-DNA雜交、16S rRNA全序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育地位）對(duì)海南樣品分離得到的菌株CPCC100156T、 CPCC100154T和CPCC100155進(jìn)行了分類研究。綜合表型、基因型和系統(tǒng)發(fā)育三個(gè)層面的信息，確定了菌株CPC

8、C100156T、 CPCC100154T和CPCC100155的分類地位。其中CPCC100156T代表了Belnapia屬的一個(gè)新物種，建議命名為Belnapia rosea sp.nov.（該研究已經(jīng)發(fā)表于IJSEM）;菌株CPCC100154T和CPCC100155同屬于Steroidobacter屬的1個(gè)新物種，建議命名為Steroidobacter hainanensis sp.nov.，典型菌株為CPCC100154T。<