NNK聯(lián)合LPS孵育對小鼠巨噬細(xì)胞的增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：觀察脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、4-（甲基亞硝氨基）-3-吡啶-1-丁酮（NNK）對小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7細(xì)胞增殖能力及C-myc、NF-κB、iNOS、Arginase、TNFα、IL-1α、IL-6基因表達(dá)的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7細(xì)胞，用Real time-PCR的方法檢測不同濃度的LPS、NNK刺激Raw264.7細(xì)胞C-myc mRNA的表達(dá)情況，選擇

2、藥物最佳濃度。利用細(xì)胞計數(shù)儀對比所選濃度LPS、NNK及LPS聯(lián)合NNK不同孵育時間對Raw264.7細(xì)胞增殖能力的影響；Real time-PCR方法檢測C-myc及相關(guān)基因mRNA的表達(dá)情況；Western Blot技術(shù)檢測Raw264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子C-myc蛋白的表達(dá)情況；免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測iNOS蛋白的表達(dá)情況；酶聯(lián)免疫技術(shù)定量炎性介質(zhì)TNF-a及IL-6的含量。
　　結(jié)果：(1)濃度為10 ng/ml、250ng/

3、ml、1μg/ml和4μg/ml的LPS均可上調(diào)Raw264.7細(xì)胞的C-myc mRNA的相對表達(dá)量；1μg/ml LPS上調(diào)作用較其他組顯著性增強(qiáng)(P<0.05）。濃度為5μM、10μM、25μM和100μM的NNK對Raw264.7細(xì)胞的C-myc mRNA表達(dá)影響有降低趨勢，與對照組相比差異無顯著性。（2）選擇濃度為1μg/ml LPS+10μM NNK聯(lián)合孵育Raw264.7細(xì)胞,可見24h及36h
　　NNK聯(lián)合LPS

4、孵育組C-myc mRNA的相對表達(dá)量較LPS組顯著性降低（P24h<0.0001，P36h<0.05）。（3）LPS和LPS聯(lián)合NNK孵育均可降低Raw264.7細(xì)胞的增殖活性（P<0.05），聯(lián)合孵育48h的抑制作用較單獨LPS孵育略強(qiáng)(P<0.05)。（4）LPS孵育24h、36h、48h均可顯著刺激Raw264.7細(xì)胞NF-κB、Arginase、iNOS mRNA的表達(dá)。單獨NNK孵育24h、36h、48h可見NF-κB、Ar

5、ginase、iNOS mRNA相對表達(dá)量與對照相比無差異顯著性。LPS聯(lián)合NNK孵育24h、36h NF-κB、Arginase、iNOS mRNA相對表達(dá)量升高；其中孵育24h、36h的NF-κB、孵育36h的iNOS mRNA表達(dá)量顯著高于單獨LPS刺激組（P<0.05）；LPS聯(lián)合NNK孵育48h，Arginase mRNA表達(dá)量也升高，但低于單獨LPS刺激組（P<0.01）。（5）LPS及LPS聯(lián)合NNK孵育Raw264.7細(xì)

6、胞24h，IL-1a及IL-6 mRNA的表達(dá)較對照組明顯升高，差異具有顯著性（P<0.01）。LPS聯(lián)合NNK組IL-1α mRNA表達(dá)量顯著高于LPS組(P<0.05)。（6）Western Blot結(jié)果顯示NNK、LPS、LPS聯(lián)合NNK組孵育24h和48h C-myc蛋白表達(dá)量無明顯變化。(7)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示LPS及LPS聯(lián)合NNK孵育48h，iNOS蛋白表達(dá)量明顯升高。（8）LPS和LPS聯(lián)合NNK聯(lián)合孵育Raw264.

7、7細(xì)胞24h、48h，其IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)均較對照組顯著升高，LPS聯(lián)合NNK孵育48h IL-6蛋白表達(dá)量高于LPS組（P<0.01），LPS聯(lián)合NNK孵育24h TNF-α蛋白表量達(dá)低于LPS組（P<0.05）。
　　結(jié)論：NNK本身對巨噬細(xì)胞的增殖、向M1型轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)無明顯作用。LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞C-myc、NF-κB、iNOS、Arginase、IL-1a、IL-6 mRNA的急劇升高，抑制該細(xì)胞的增