抗病毒先天性免疫通過(guò)調(diào)控肺上皮干-祖細(xì)胞表達(dá)及損傷-修復(fù)反應(yīng)介導(dǎo)COPD氣道重建和肺泡稀薄化.pdf

1、第一部分、肺上皮干/祖細(xì)胞的篩選和鑒定
　　 目的：分離、篩選和鑒定肺上皮干/祖細(xì)胞，分析其與肺上皮修復(fù)反應(yīng)的關(guān)系。
　　 方法：首先從小鼠肺組織中獲取單個(gè)肺細(xì)胞懸液，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD45-/CD31-/Sca-1+(Stem Cell Antigen-1)細(xì)胞在正常小鼠肺內(nèi)的表達(dá)水平及其細(xì)胞周期，并采用流式細(xì)胞分選術(shù)從肺單細(xì)胞懸液中篩選出該細(xì)胞群，使用免疫熒光染色對(duì)其具體細(xì)胞成分進(jìn)行鑒別，體外培養(yǎng)評(píng)估其增殖能力，

2、最后通過(guò)病毒病原相關(guān)分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMP)感染模型明確該細(xì)胞群與肺上皮修復(fù)反應(yīng)的關(guān)系。
　　 結(jié)果：正常小鼠肺內(nèi)有低水平的CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞表達(dá)。與CD45-/CD31-/Sca-1-細(xì)胞相比，CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞主要處于DNA合成期或合成后期/分裂期，且在體外培養(yǎng)過(guò)程中僅CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞

3、分裂增殖形成細(xì)胞集落；細(xì)胞免疫熒光染色顯示CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞主要由細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞組成。這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有增殖能力的CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞是一個(gè)異質(zhì)干/祖細(xì)胞群。之后體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在病毒雙鏈RNA(dsRNA)模擬物Poly(I：C)誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的同時(shí)，肺CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞的表達(dá)水平出現(xiàn)上升，并隨著凋亡程度的加重而逐漸升高；

4、且在此過(guò)程中，CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞表達(dá)水平的變化與肺上皮Ki67陽(yáng)性細(xì)胞所呈現(xiàn)的動(dòng)力學(xué)十分相似。由此可知Poly(I：C)刺激同時(shí)觸發(fā)了肺上皮的損傷和修復(fù)反應(yīng)，且肺CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞參與了肺上皮的再生修復(fù)過(guò)程。
　　 結(jié)論：肺CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞是具有部分祖細(xì)胞特性的異質(zhì)干/祖細(xì)胞群，該細(xì)胞群的表達(dá)水平代表了Poly(I：C)刺激下肺上皮組織的再生修復(fù)反應(yīng)。
　

5、　 第二部分、香煙煙霧和病毒PAMP聯(lián)合誘導(dǎo)的COPD小鼠模型中肺上皮干/祖細(xì)胞表達(dá)和損傷/修復(fù)失衡
　　 目的：觀察COPD(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)肺組織中上皮干/祖細(xì)胞的表達(dá)及不同解剖區(qū)域上皮的損傷/修復(fù)反應(yīng)。
　　 方法：通過(guò)香煙煙霧(Cigarette Smoke，CS)和病毒PAMP模擬物Poly(I：C)聯(lián)合暴露建立肺損傷模型，檢測(cè)該模型肺組織中氣道和肺

6、泡的病理改變，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖細(xì)胞群在COPD肺組織中的表達(dá)水平，通過(guò)TUNEL和Ki67等免疫熒光染色分別觀察氣道和肺泡上皮細(xì)胞的凋亡和增殖情況。
　　 結(jié)果：香煙煙霧和Poly(I：C)聯(lián)合暴露的小鼠肺組織中出現(xiàn)顯著氣道壁增厚和肺泡結(jié)構(gòu)破壞，是成功模擬了氣道纖維化重建和肺泡稀薄化的COPD模型；在該COPD模型中，肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，

7、但與Poly(I：C)組比較其表達(dá)水平明顯下降，表明香煙煙霧抑制了Poly(I：C)誘導(dǎo)的肺上皮干/祖細(xì)胞擴(kuò)增；TUNEL染色和免疫熒光染色顯示模型中氣道上皮細(xì)胞以增殖反應(yīng)為主，而肺泡上皮細(xì)胞以凋亡反應(yīng)為主。
　　 結(jié)論：香煙煙霧和病毒PAMP模擬物Poly(I：C)聯(lián)合暴露誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型是同時(shí)模擬了COPD小氣道纖維化重建和肺泡稀薄化的COPD模型；香煙煙霧抑制了Poly(I：C)誘導(dǎo)的肺CD45-/CD31-/Sca-

8、1+上皮干/祖細(xì)胞擴(kuò)增，提示香煙煙霧和Poly(I：C)聯(lián)合暴露刺激通過(guò)影響肺上皮干/祖細(xì)胞的表達(dá)導(dǎo)致異常的肺上皮修復(fù)反應(yīng)；在該COPD模型中氣道和肺泡上皮呈現(xiàn)相反的上皮細(xì)胞損傷/修復(fù)失衡：氣道上皮以增殖反應(yīng)為主，而肺泡上皮則以凋亡反應(yīng)為主，與觀察到的氣道纖維化重建和肺泡稀薄化改變一致，提示肺上皮損傷/修復(fù)失衡參與COPD肺組織重建。
　　 第三部分、抗病毒先天性免疫對(duì)COPD中肺上皮干/祖細(xì)胞和損傷/修復(fù)反應(yīng)的影響
　　

9、 目的：檢測(cè)抗病毒先天性免疫TLR3(Toll-Like Receptor3)和RLH-MAVS(RIG-Like Helicases-Mitochondrial Antiviral SignalingProtein)信號(hào)通路對(duì)COPD肺組織中上皮干/祖細(xì)胞表達(dá)和不同解剖區(qū)域上皮損傷/修復(fù)反應(yīng)的影響。
　　 方法：使用野生型(Wild Type，WT)、TLR3基因敲除(TLR3-/-)及MAVS基因敲除(MAVS-/-)小鼠

10、重復(fù)香煙煙霧和Poly(I：C)聯(lián)合暴露誘導(dǎo)的COPD模型，檢測(cè)各型小鼠肺組織中氣道和肺泡的病理改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD45-/CD31-/Sca-1+肺上皮干/祖細(xì)胞的表達(dá)水平，并通過(guò)TUNEL和Ki67等免疫熒光染色分別觀察氣道和肺泡上皮細(xì)胞的凋亡和增殖情況。
　　 結(jié)果：香煙煙霧和Poly(I：C)聯(lián)合暴露后，TLR3-/-和MAVS-/-小鼠肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度和CD45-/CD31-/Sca-1+細(xì)胞表達(dá)均較WT小

11、鼠明顯下降，敲除MAVS基因同時(shí)逆轉(zhuǎn)了氣道纖維化重建和肺泡稀薄化，而敲除TLR3基因僅改善了氣道增生和纖維化。TUNEL和免疫熒光染色的結(jié)果顯示TLR3和MAVS表達(dá)缺失均同時(shí)抑制了肺上皮細(xì)胞的凋亡和增殖反應(yīng)，但在CS+P暴露的TLR3-/-小鼠肺組織中，氣道上皮細(xì)胞凋亡/增殖水平幾乎持平，肺泡上皮中增殖細(xì)胞比例明顯低于凋亡細(xì)胞比例；而CS+P暴露的MAVS-/-小鼠氣道和肺泡上皮細(xì)胞凋亡/增殖水平均接近同一水平，說(shuō)明敲除MAVS基因能

12、夠同時(shí)逆轉(zhuǎn)CS+P誘導(dǎo)的氣道上皮過(guò)度修復(fù)和肺泡上皮的修復(fù)不足，而TLR3基因缺失僅抑制了氣道上皮的過(guò)度修復(fù)。
　　 結(jié)論：在香煙煙霧和Poly(I：C)誘導(dǎo)的COPD模型中，TLR3和RLH-MAVS信號(hào)通路參與和促進(jìn)了肺組織炎癥，并通過(guò)調(diào)控肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖細(xì)胞表達(dá)以及上皮細(xì)胞凋亡和增殖反應(yīng)介導(dǎo)肺組織重建，其中，氣道上皮呈現(xiàn)修復(fù)過(guò)度的損傷/修復(fù)失衡主要受到TLR3信號(hào)通路的調(diào)控，而肺泡上皮表現(xiàn)為修