敲減Anp32a通過下調(diào)JNK-P38MAPKs活性抑制多柔比星誘導的心肌細胞凋亡.pdf

1、目的:我們的前期實驗證實Anp32a在心肌細胞中有表達。敲減Anp32a在心肌細胞中的表達可抑制多柔比星誘導的心肌細胞凋亡。MAPKs在多柔比星誘導的心肌細胞凋亡中起重要作用。我們假設:敲減Anp32a經(jīng)MAPKs通路抑制多柔比星誘導的凋亡。
　　方法:原代心肌細胞培養(yǎng)并運用肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)對其進行鑒定。實驗分組:正常心肌細胞組（CMs組）、多柔比星(DOX)組、空載病毒(NC-LV)組、空載病毒+多柔比星(NC-LV+DO

2、X)組、目的基因病毒(Anp)組、目的基因+多柔比星(Anp+DOX)組。將構(gòu)建的lentivirus-scrRNAi和lentivirus-Anp32a/GV115-RNAi載體分別轉(zhuǎn)染入NC-LV組、NC-LV+DOX組和Anp組、Anp+DOX組。轉(zhuǎn)染72h后應用免疫熒光法檢測其轉(zhuǎn)染心肌細胞的效率，并于DOX組、NC-LV+DOX組和Anp+DOX組加入多柔比星(1μ mol/L)作用12h建立心肌細胞凋亡模型，應用Annexin

3、V-FITC法檢測6組心肌細胞凋亡率，以心肌細胞凋亡率作為心肌細胞凋亡的觀察指標，觀察敲減Anp32a對多柔比星誘導的心肌細胞凋亡的影響。運用Westernblot法檢測CMs組、DOX組、Anp組和Anp+DOX組的ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、P38MAPKs、p-P38MAPKs蛋白表達水平。數(shù)據(jù)運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行多組間單因素方差分析和組間t檢驗。
　　結(jié)果:體外原代培養(yǎng)的心肌細胞，呈多

4、邊形、梭形等，部分細胞聚集成細胞簇，呈放射狀排列的同心圓狀，搏動呈同步性，搏動頻率多為60-100次/分。對細胞進行cTnⅠ鑒定顯示85％以上細胞呈陽性表達，符合心肌細胞特征。轉(zhuǎn)染NC-LV和Anp32a敲減重組慢病毒心肌細胞72h后，熒光顯微鏡觀察分別發(fā)現(xiàn)90％和80％以上的心肌細胞表達綠色熒光蛋白。分析AnnexinV-FITC法測定DOX組和CMs組心肌細胞凋亡率[(31.94±1.24)％vs(3.62±0.53)％，(p＜0.

5、01)]，提示多柔比星誘導體外培養(yǎng)的心肌細胞凋亡模型成功;分析NC-LV組與CMs組、NC-LV+DOX組與DOX組凋亡率[(4.53±0.61)％vs(3.62±0.53)％，(p＞0.05)]、[(33.14±1.57)％vs(31.94±1.24)％，(p＞0.05)]，提示慢病毒對心肌細胞的毒性不影響結(jié)果分析;分析Anp+DOX組與DOX組凋亡率[(16.62±2.07)％vs(31.94±1.24)％，(p＜0.05)]，說明

6、敲減Anp32a能部分抑制多柔比星誘導的心肌細胞凋亡。分析DOX組與CMs組p-ERK1/2/ERK1/2比值未見明顯差異，無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，說明多柔比星未引起ERK1/2活性的變化;DOX組與CMs組p-JNK/JNK比值高了1.5倍，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，說明多柔比星通過增加JNK的活性誘導心肌細胞凋亡;DOX組與CMs組p-P38/P38MAPKs比值高了0.9倍，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，說明多柔

7、比星通過增加P38MAPKs的活性誘導心肌細胞凋亡。分析Anp+DOX組與DOX組p-JNK/JNK比值低了1.43倍，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，說明敲減Anp32a通過下調(diào)JNK活性抑制多柔比星誘導的凋亡;Anp+DOX組與DOX組p-P38/P38比值低了0.83倍，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，說明敲減Anp32a通過下調(diào)P38MAPKs活性抑制多柔比星誘導的凋亡。
　　結(jié)論:敲減Anp32a可能通過下調(diào)JNK、