骨關節(jié)炎血清蛋白組學實驗研究.pdf

1、目的:對正常人群及骨關節(jié)炎患者的血清蛋白電泳圖譜進行配對分析比較，尋找差異蛋白質點。應用質譜鑒定技術，對差異蛋白質點進行鑒定。經相關文獻檢索，分析所鑒定的蛋白質在骨關節(jié)炎的關系。為今后骨關節(jié)炎致病機制研究，生物標記物尋找，新的治療靶點的研究奠定基礎。 材料與方法: 10名符合診斷標準的膝關節(jié)OA患者(1名男性和9名女性，平均年齡60.6±7.4，BMI25.8±4.4)和10名正常志愿者(1名男性和9名女性，平均年齡55

2、.3±4.5，BMI25.5±3.5)分別組成病例組與對照組，兩組性別相匹配，年齡、BMI相當以減少混雜因素。本實驗符合相關衛(wèi)生部門的倫理委員會的原則。嚴格執(zhí)行赫爾辛基宣言的相關規(guī)定，并且已征得所有入組人員的同意。對所有研究對象收集靜脈血，在每個樣本上加入蛋白酶抑制劑，然后分離血清樣本保存在-80℃?zhèn)溆?。?0微升血清樣本放入1mL的離心管里面，根據ProteoPrepBlueAlbumin＆IgGDepletionKit(SIGMA)

3、試劑盒和2-Dcleanupkit(AmershamBiosciences)試劑盒的說明分別用于清除樣本中的白蛋白與球蛋白和鹽與脂。然后利用牛血清作為標準運用Bradford法測定濃度。按照G(o)rg等方法和Bio-Rad儀器操作手冊進行雙相電泳。第一相等電聚焦(IEF)，血清的上樣量總體積為0.35ml，(含總蛋白質0.3mg)。50V重泡脹12h后進行等電聚焦，依次經過150V1h、500V3h、1000V1h、5000V1h、7

4、000V2h、10000V至總電壓積為50000伏小時。等電聚焦結束后，迅速取出IPG膠條，分別置于平衡液A(6mmol/LUrea，2％SDS，50mmol/LTris—HCLpH8.8，30％甘油，2％DTT)、平衡液B(6mmol/LUrea，2％SDS，50mmol/LTris—HCLpH8.8，30％甘油，2.5％碘乙酰胺)中各平衡15分鐘。將平衡好的膠條轉入proteanⅡxicell垂直電泳槽中進行第二向電泳，聚丙烯酰胺凝

5、膠濃度為12％，電泳條件為：每膠3W電泳30min，然后每膠7W恒功率，直至溴酚藍指示線到達凝膠底部停止電泳，對凝膠進行銀染。凝膠通過ImageScannerⅡ透射掃描儀及Labscan掃描軟件進行掃描獲取圖像。數據以SPSS15.0進行處理。軟件找出差異點后沿邊緣切取凝膠上的差異蛋白質點(表達量差異在3倍以上)，置于1.5mlEP管內。蛋白點經脫色，脫水，抽干。加入5uL～10ulTPCK處理的胰蛋白酶(12.5ng/uL)，4℃冰箱

6、中約30分鐘，取出后在37℃烘箱中酶解過夜。加入50％乙腈和0.1％TFA混合液60uL，輕微振蕩萃取30-40min后，將溶液轉移到新的96孔板內，重復3次。將肽段溶液在N2流下吹干濃縮，然后將完全干燥的肽段重新溶解于0.7uLCHCA溶液(0.5g/L，由0.1％TFA和50％CAN配制)中，并將其全部點到不銹鋼MALDI靶板上并分析。MALDI—TOF—MS分析采用反射模式，正離子譜測定，激光源為355nm波長的Nd：YAG激光器

7、，加速電壓為20KV。儀器先用myoglobin酶解肽段進行外標校正?；|和樣品的PMF質量掃描范圍為700-3500Da。然后直接選擇與對照基質的PMF圖有差異的肽段離子進行MS/MS分析。所有實驗樣品的質譜圖均用默認模式獲得。利用軟件Mascotdistiller過濾基線峰、識別信號峰。利用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數據庫(http：//www.matrixscience.com)，尋找匹配的相

8、關蛋白質，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質為何種蛋白質。 結果: 1、通過二維電泳圖普比較發(fā)現7個差異表達蛋白，其中6個在關節(jié)炎組中呈低表達，1個呈高表達。 2、經質譜鑒定為分別為：6個低表達蛋白分別為對氧磷酶1、對氧磷酶3、α-1-微球蛋白/bikunin前體蛋白、載脂蛋白M、免疫球蛋白輕鏈(或與之極類似的推定的未知特性蛋白)、四連接素，高表達蛋白為載脂蛋白LI。 結論: 本實驗結果提示APO