TNF-α對(duì)EPCs分化的影響及其在肉雞肺血管叢樣病變形成中的作用.pdf

1、肺血管叢樣病變是重度肺動(dòng)脈高壓(PAH)病人的特異性病變，該病變主要發(fā)生在肺小動(dòng)脈分叉處，由內(nèi)皮樣細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞混合構(gòu)成“腎小球”樣結(jié)構(gòu)阻塞在血管腔內(nèi)，病變血管周圍通常伴有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤。肉雞對(duì)PAH高度易感，并可形成與PAH病人相似的叢樣病變。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在血管修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究旨在揭示EPCs與肉雞叢樣病變形成之間的關(guān)系，并探索炎癥反應(yīng)在這一過程中的作用。
　　

2、實(shí)驗(yàn)一:EPCs與肺血管叢樣病變的關(guān)系研究。1日齡肉雞常規(guī)飼養(yǎng)至6周齡，每周隨機(jī)選取至少6只撲殺，采集心臟，分離右心室和左心室，計(jì)算右心/全心比(RV/TV);采集右肺相同部位肺組織，常規(guī)石蠟切片，H·E染色，觀察肺血管叢樣病變的形成情況，并計(jì)算叢樣病變密度;采用免疫組化法鑒定EPCs;采用免疫組化法結(jié)合病理圖像分析，檢測(cè)每張肺組織切片中與叢樣病變相對(duì)應(yīng)的來源血管中CD133和CD31的表達(dá)，并隨機(jī)挑選正常血管作為對(duì)照。結(jié)果:RV/TV

3、值顯示所有參試肉雞均未形成PAH;在各年齡階段肉雞中均可觀察到叢樣病變;叢樣病變呈動(dòng)態(tài)發(fā)展，幼稚叢樣病變主要由上皮樣細(xì)胞構(gòu)成，成熟病變則由泡沫樣巨噬細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和結(jié)締組織基質(zhì)構(gòu)成;肺組織中叢樣病變密度在前3周內(nèi)呈年齡依賴性下降，至第4周齡時(shí)顯著升高，此后逐漸下降，提示4周齡肉雞肺組織中有新的叢樣病變形成;免疫組化染色結(jié)果顯示，幼稚叢樣病變中的上皮樣細(xì)胞主要為EPCs(CD133+/VEGFR-2+)，但成熟病變中的巨噬細(xì)胞亦呈CD

4、133和VEGFR-2強(qiáng)陽性染色，提示病變形成過程中存在EPCs向巨噬細(xì)胞分化現(xiàn)象。叢樣病變來源血管內(nèi)皮中CD133表達(dá)較正常血管顯著上升(P＜0.001)，但CD31的表達(dá)顯著下降(P＜0.001)。上述結(jié)果提示:肺血管叢樣病變的形成與EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化障礙有關(guān)，EPCs向巨噬細(xì)胞分化可能是導(dǎo)致其失去血管修復(fù)能力并最終促進(jìn)叢樣病變形成的重要原因。
　　實(shí)驗(yàn)二:腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在肺血管叢樣病變形成中的作用及機(jī)制研

5、究。方法:選擇14日齡臨床健康肉雞12只，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組于氣管內(nèi)滴注100μL濃度為5μg/mL的TNF-α，3d后再采用相同的方法滴注1次，對(duì)照組滴注相同劑量生理鹽水。于最后一次給藥3d后撲殺肉雞，采集右肺下1/3部分制作連續(xù)石蠟切片，計(jì)數(shù)叢樣病變數(shù)量并計(jì)算病變密度;采用免疫組化法鑒定EPCs(CD133+/VEGFR-2+)和巨噬細(xì)胞(KUL01+細(xì)胞)。分離肉雞外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成

6、纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和胰島素樣生長因子(IGF)聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞向EPCs分化。培養(yǎng)至第4d時(shí)，在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為10、50和100ng/mL的重組TNF-α刺激細(xì)胞，以正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照。分別于刺激后第3、6和9d，采用Dil-ac-LDL/FITC-UEA-1熒光雙染法鑒定EPC表型;采用Boyden小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;采用qPCR法檢測(cè)培養(yǎng)物中EPCs標(biāo)志CD133和VEGFR-2、內(nèi)

7、皮細(xì)胞標(biāo)志CD31和巨噬細(xì)胞標(biāo)志CD44mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，外源性給予TNF-α可顯著促進(jìn)肺血管叢樣病變形成(P＜0.05);幼稚叢樣病變中的細(xì)胞呈CD133、VEGFR-2和KUL01陽性。TNF-α(10-100ng/mL)作用6-9d后，Dil-ac-LDL/FITC-UEA-I雙染陽性細(xì)胞百分率較對(duì)照組顯著下降，提示EPCs數(shù)量減少;不同濃度TNF-α于不同作用時(shí)間點(diǎn)均顯著抑制EPCs增殖和遷移;TNF-α(50ng/mL